目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,用于开发包虫病新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增细粒棘球蚴Eg95和Eg.f...目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,用于开发包虫病新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增细粒棘球蚴Eg95和Eg.ferritin基因,采用基因拼接法将Eg95和Eg.ferritin融合,将该融合基因Eg95-Eg.ferritin插入到p Fast Bac DUAL载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf-9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western blot鉴定。结果成功克隆了Eg95和Eg.ferritin基因,通过柔性氨基酸linker成功获得了融合基因Eg95-Eg.ferritin,经PCR和酶切鉴定成功构建了重组质粒p Fast Bac DUAL-Eg95-Eg.ferritin,Western blot结果证实表达蛋白能够被包虫病人标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达了细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,与包虫病人标准阳性血清具有良好的反应性。展开更多
文摘目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,用于开发包虫病新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增细粒棘球蚴Eg95和Eg.ferritin基因,采用基因拼接法将Eg95和Eg.ferritin融合,将该融合基因Eg95-Eg.ferritin插入到p Fast Bac DUAL载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf-9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western blot鉴定。结果成功克隆了Eg95和Eg.ferritin基因,通过柔性氨基酸linker成功获得了融合基因Eg95-Eg.ferritin,经PCR和酶切鉴定成功构建了重组质粒p Fast Bac DUAL-Eg95-Eg.ferritin,Western blot结果证实表达蛋白能够被包虫病人标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达了细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,与包虫病人标准阳性血清具有良好的反应性。
文摘目的初步探索Notch信号对树突状细胞(dendritic cell,DC)介导的抗寄生虫感染免疫反应的影响。方法体外培养骨髓来源的小鼠DC细胞,利用γ-分泌酶抑制剂N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine tbutyl ester,DAPT于不同时间段处理细胞,阻断DC的Notch信号通路,培养第7d时收集DC,用细粒棘球蚴重组抗原铁蛋白(ferritin protein of Echinococcus granulosus,Eg.ferritin)体外刺激DC,利用扫描电镜观察DC形态的改变,采用流式细胞术检测DC表面分子MHCⅡ、CD40及CD80/CD86的表达情况。结果 DC细胞数量随DAPT浓度的增高而降低;经不同浓度DAPT于不同时间段处理后,DC细胞中Notch1mRNA的表达受到抑制,以50μmol/L DAPT在第0d处理DC,对Notch1mRNA的抑制效果更显著(P<0.05);Eg.ferritin和LPS均能刺激DC细胞表面树突的生成及表面分子MHCⅡ、CD40及CD80/CD86的表达,且Eg.ferritin比LPS的刺激作用更显著(P<0.05),而加入DAPT后,DC细胞表面树突的生成减少,各表面分子的表达水平降低(P<0.05),并削弱了Eg.ferritin和LPS的刺激作用。结论Eg.ferritin能促进DC细胞的分化成熟,而阻断Notch信号通路会影响DC细胞的分化成熟,并降低DC细胞对Eg.ferritin的反应能力。其分子机制涉及Notch信号通路。
