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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量:3
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作者 王永飞 邓博文 +5 位作者 刘晓艳 哈尔勒哈·阿曼太 郭嘉栋 周正国 蔡江 李有文 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期689-699,共11页
[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu... [目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 重叠延伸PCR ef-tu基因 多克隆抗体
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绵羊肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量:6
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作者 黄坚 尹正军 +1 位作者 岳华 汤承 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1270-1276,共7页
为建立快速检测绵羊肺炎支原体的荧光定量PCR方法,根据EF-Tu基因序列设计合成引物,构建含有EF-Tu基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并用于临床样本的检测。结果显示,本研究建立的方法能特... 为建立快速检测绵羊肺炎支原体的荧光定量PCR方法,根据EF-Tu基因序列设计合成引物,构建含有EF-Tu基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并用于临床样本的检测。结果显示,本研究建立的方法能特异性扩增绵羊肺炎支原体,与其他病原无交叉反应,最低检测限为5 copies/L,在5×10^4-5×10^9稀释度范围内具有良好的线性关系(r2=0.996),检测的批内和批间变异系数均小于5%。对临床肺组织样本中绵羊肺炎支原体的检出率(105/134,78%)与基于P113基因的q RT-PCR方法的相符,而对鼻腔棉拭子样本的检出率(27/50,54%)略高于后者(25/50,50%)。对人工感染绵羊肺炎支原体山羊肺的病变部位、病健交界部位和无明显病变部位的检出率分别为1/6、6/6和4/6,确定肺的病健交界部位为最佳采样部位。对采自四川、新疆、青海的439份表观健康羊肺绵羊肺炎支原体的平均检出率分别为48%(61/126)、63%(103/163)和75%(113/150),提示受检羊群仍存在严重的绵羊肺炎支原体带菌感染情况。该方法的建立对绵羊肺炎支原体感染的监测与快速诊断有重要意义。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 ef-tu基因 荧光定量PCR 检测部位 临床应用
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滑液囊支原体贵州株膜蛋白EF-Tu、pdhβ免疫原性分析 被引量:2
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作者 宋春 王柏林 +4 位作者 李梅 文明 王开功 陈常秀 程振涛 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第7期7-12,共6页
为了研究鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)膜蛋白EF-Tu和pdhβ的免疫应答效果,试验针对目的基因设计特异性引物,经PCR扩增并构建原核表达载体,应用相关软件对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,对目的蛋白进行诱导表达并... 为了研究鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)膜蛋白EF-Tu和pdhβ的免疫应答效果,试验针对目的基因设计特异性引物,经PCR扩增并构建原核表达载体,应用相关软件对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,对目的蛋白进行诱导表达并进行动物免疫试验。结果表明:PCR扩增EF-Tu和pdhβ基因得到特异性条带,大小为1185 bp和993 bp;成功构建了重组质粒pET32a-EF-Tu和pET32a-pdhβ;滑液囊支原体贵州分离株(MS-GZ-ZJ株)同其他流行株的EF-Tu基因同源性在99.7%~100%之间,pdhβ基因同源性在99.6%~100%之间,说明MS-GZ-ZJ株EF-Tu、pdhβ基因高度保守;EF-Tu、pdhβ蛋白的分子质量分别为43 ku和35 ku,是稳定的亲水蛋白;EF-Tu蛋白二级结构以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链为主,pdhβ蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。表达的蛋白大小与预期相符,EF-Tu蛋白主要为可溶性表达,pdhβ蛋白主要为包涵体表达;EF-Tu、pdhβ重组蛋白均能与MS阳性血清特异性结合。EF-Tu重组蛋白不能单独诱导细胞免疫应答,而pdhβ重组蛋白能刺激鸡群产生少量的白细胞介素4(IL-4),两个重组蛋白混合能诱导少量的IL-2和IL-4,但比疫苗组低很多;体液免疫应答效果不明确。说明单独使用经预测免疫原性好的蛋白质不一定能诱导动物机体产生良好的反应原性。 展开更多
关键词 滑液囊支原体 ef-tu基因 pdhβ基因 生物信息学 原核表达 免疫原性
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产气荚膜梭菌EF-Tu基因的原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量:2
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作者 解真真 郑晓星 +2 位作者 李广兴 张艳 李兰兰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期111-117,共7页
通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-b... 通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导5h后蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为69ku。间接ELISA方法检测的多抗血清效价为1∶262 144。Western-blot结果证实,重组蛋白与产气荚膜梭菌ATCC13124株制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。Western-blot和间接免疫荧光结果表明,多抗血清能分别与pGEX-EF重组蛋白、ATCC13124菌体裂解液、pcDNA3.1-EF-Tu瞬时转染后的BHK-21细胞及ATCC13124感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合反应。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 ef-tu基因 多克隆抗体 WESTERN-BLOT
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链球菌SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 徐卫松 刘中原 +3 位作者 程慧芳 王亚宾 付彤 魏战勇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期877-880,共4页
为建立链球菌的快速定量检测方法,本研究根据链球菌延伸因子EF-Tu基因保守序列设计一对引物,以链球菌DNA为模板通过PCR扩增其197 bp的EF-Tu基因片段,并克隆至p MD18-T载体中。以纯化的重组质粒为标准品建立标准曲线,建立了链球菌SYBR Gr... 为建立链球菌的快速定量检测方法,本研究根据链球菌延伸因子EF-Tu基因保守序列设计一对引物,以链球菌DNA为模板通过PCR扩增其197 bp的EF-Tu基因片段,并克隆至p MD18-T载体中。以纯化的重组质粒为标准品建立标准曲线,建立了链球菌SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示在3.98×106拷贝/m L^3.98×102拷贝/μL范围内具有较好的线性关系,相关系数为R2=0.995,最低检出量为39.8拷贝/μL。此外,该方法具有良好的特异性,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等其他细菌的检测结果均为阴性。重复性试验表明,该方法的组内和组间变异系数均低于1.0%。利用该方法对34份疑似链球菌感染病料进行检测,结果显示本研究所建立的方法对链球菌的检出率比常规PCR高14.7%,比细菌分离鉴定方法高29.4%。表明该方法可以用于对链球菌感染的定量研究和流行病学调查。 展开更多
关键词 链球菌 SYBR Green 荧光定量PCR ef-tu基因
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