-
题名ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体的构建
被引量：2
- 1
-
-
作者
何剑
廖红伍
阳学风
-
机构
南华大学附属南华医院消化内科
-
出处
《临床肝胆病杂志》
CAS
北大核心
2019年第6期1286-1292,共7页
-
基金
国家自然科学基金面上项目(81373465)
湖南省自然科学省市联合基金(2016JJ5010)
湖南省卫生计生委科研课题(A2017015)
-
文摘
目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1p24抗原ELISA法"测定样品滴度。选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察感染率。并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量。2组间比较采用两独立样本t检验。结果(1)根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。(2)通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测定样品病毒滴度为3×108TU/ml;表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。(3)用ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),荧光观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定;使用Real-time PCR的方法及Western blot检测实验组人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因在mRNA和蛋白质水平的表达量受到抑制(P值均<0.05),敲减效率达到70.5%。结论成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品,并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404)。
-
关键词
ecel1基因
慢病毒载体
肝肿瘤
-
Keywords
ecel1 gene
lentiviral vector
liver neoplasms
-
分类号
R575
[医药卫生—消化系统]
Q78
[医药卫生—内科学]
-
