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BCSP31蛋白双抗夹心ELISA定量方法的建立及应用
1
作者 陈凯楠 李金斗 +5 位作者 丁佳欣 冯嘉轩 于喜冰 单春晖 汪思捷 丁壮 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期699-705,共7页
通过原核表达系统制备、纯化布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗核心组分BCSP31蛋白,并将其作为免疫原及标准品分别免疫新西兰大白兔(1mg/只)和BALB/c鼠(200μg/只)制备兔源捕获多克隆抗体和鼠源检测多克隆抗体,对双抗夹心ELISA方法的捕获抗体和... 通过原核表达系统制备、纯化布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗核心组分BCSP31蛋白,并将其作为免疫原及标准品分别免疫新西兰大白兔(1mg/只)和BALB/c鼠(200μg/只)制备兔源捕获多克隆抗体和鼠源检测多克隆抗体,对双抗夹心ELISA方法的捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数、封闭液种类及封闭条件、酶标二抗工作条件等参数进行优化,结果显示兔多克隆抗体最佳包被浓度和鼠多克隆抗体最佳稀释倍数均为1∶1600、3%脱脂奶粉封闭1h、酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4000、酶标二抗孵育时间1h、显色时间为15min的条件下建立的双抗夹心ELISA方法效果最好。按照上述最佳反应条件对布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗(BCSP31-cVLPs)核心抗原成分BCSP31蛋白进行定量检测,并对其敏感性、特异性、重复性等性能进行评价,结果显示1μL布鲁菌嵌合病毒样颗粒中的BCSP31含量约占总蛋白含量的14.187%;将布鲁菌嵌合病毒样颗粒稀释640倍后,P/N值仍大于2.1,有较高的敏感性;与FAdV、IBDV、NDV、AIV等其他病毒样颗粒均无交叉反应,特异性高;批间和批内变异系数均在10%以下,重复性良好。该方法的建立为推进布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗的质量控制标准建立及商品化奠定了基础。 展开更多
关键词 布鲁菌病嵌合病毒样颗粒 BCSP31蛋白 双抗夹心elisa方法 参数优化 应用
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基于GII.4型诺如病毒P蛋白的GII型广谱单克隆抗体制备及应用 被引量：3
2
作者 高珺珊 薛亮 +4 位作者 蔡伟程 廖颖茵 左月婷 张菊梅 吴清平 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期1317-1325,共9页
人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是全球引起急性胃肠炎的重要传染病原。该病毒遗传多样性丰富,包括了5个基因群以及39种基因型,免疫学检测受限。因此,本研究旨在制备广谱性的HuNoV单克隆抗体,并建立可检测多种基因型的双抗体夹... 人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是全球引起急性胃肠炎的重要传染病原。该病毒遗传多样性丰富,包括了5个基因群以及39种基因型,免疫学检测受限。因此,本研究旨在制备广谱性的HuNoV单克隆抗体,并建立可检测多种基因型的双抗体夹心ELISA方法。本研究通过表达纯化流行毒株GII.4型HuNoVs衣壳蛋白P颗粒免疫Balb/c小鼠,筛选出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体并进行评价。利用辣根过氧化物酶对抗体进行标记及配对筛选,建立了HuNoVs双抗夹心ELISA检测方法,并进行验证。结果显示:B10、1D6、1C1细胞株可分泌广谱性单克隆抗体。所建立的双抗夹心ELISA方法酶标抗体最佳工作浓度为1∶5 000,捕获抗体最佳包被浓度为2.0μg/mL,该方法检测GII.4型P颗粒最低检出限为125.0ng/mL,对常见HuNoVs GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.17基因型样本均能检出,而与轮状病毒、星状病毒、肠道病毒、札幌病毒无交叉反应。批间与批内重复变异系数均小于7%。临床样本检测结果显示,本方法与荧光定量RT-PCR结果的符合率为84%。本研究成功制备了广谱性的HuNoVs衣壳蛋白单克隆抗体,建立了可应用于HuNoVs流行毒株基因型的双抗夹心ELISA检测方法,为HuNoVs的诊断及流行病学调查提供了一种简便、特异的免疫学方法。 展开更多
关键词 人源诺如病毒 GII.4型 单克隆抗体 双抗夹心elisa 检测方法
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水产品中志贺氏菌双抗夹心ELISA检测方法建立与应用 被引量：2
3
作者 朱芳茜 何扩 +5 位作者 张秀媛 李育峰 陈一 王云峰 王硕 赵瑞平 《食品研究与开发》 CAS 北大核心 2021年第4期156-160,共5页
志贺氏菌(Shigella)通称痢疾杆菌,是一类具有传染性强和危害严重的革兰阴性食源性致病菌,广泛污染各类动物源性食品。该研究将志贺氏菌经0.5%福尔马林溶液灭活后,多次免疫雌性大耳兔获得抗志贺氏菌多克隆抗体,以抗志贺氏菌多克隆抗体作... 志贺氏菌(Shigella)通称痢疾杆菌,是一类具有传染性强和危害严重的革兰阴性食源性致病菌,广泛污染各类动物源性食品。该研究将志贺氏菌经0.5%福尔马林溶液灭活后,多次免疫雌性大耳兔获得抗志贺氏菌多克隆抗体,以抗志贺氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗志贺氏菌多克隆抗体作为检测抗体,建立快速检测志贺氏菌双抗夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明:建立的双抗夹心ELISA方法检测曲线的线性范围为4.12×104 cfu/mL~3.4×106 cfu/mL,检测限为4.12×104 cfu/mL;用此体系检测大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌等无交叉反应;水产品实际样品志贺氏菌检出限(limit of detection,LOD)为105 cfu/mg,具备较好的灵敏性和特异性。 展开更多
关键词 志贺氏菌 双抗夹心 酶联免疫吸附试验(elisa) 抗体 检测方法 水产品
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猪瘟病毒E2蛋白双抗体夹心ELISA定量方法的建立 被引量：2
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作者 候玉珍 王遵宝 +6 位作者 郑侃 赵兵 冶莲 姜智文 唐慧芬 候凤 贺笋 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第5期1523-1530,共8页
本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒(CSFV)E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量... 本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒(CSFV)E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R2值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。 展开更多
关键词 猪瘟病毒(CSFV) E2蛋白 双抗体夹心elisa法
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羊肚菌菌丝标识性抗原C6A8在菌丝不同发育阶段含量的变化规律 被引量：2
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作者 张红艳 孙伟虹 +2 位作者 熊博宇 王婷婷 王一东 《菌物研究》 CAS 2015年第3期160-163,167,共5页
为找寻、了解羊肚菌(Morchella esculenta)标识性抗原在菌丝不同发育阶段含量的变化规律,建立以抗C6A8抗原的单克隆抗体为包被抗体的ELISA双抗体夹心法;检测分析在液体培养条件下营养菌丝中C6A8抗原随培养时间延长其含量变化情况;检测... 为找寻、了解羊肚菌(Morchella esculenta)标识性抗原在菌丝不同发育阶段含量的变化规律,建立以抗C6A8抗原的单克隆抗体为包被抗体的ELISA双抗体夹心法;检测分析在液体培养条件下营养菌丝中C6A8抗原随培养时间延长其含量变化情况;检测分析单位质量羊肚菌子实体菌柄、菌盖中C6A8抗原含量差异并与营养菌丝相比较;通过对野生羊肚菌出菇地土壤基质样本的检测,分析了解在出菇时土壤基质中C6A8抗原的含量情况。羊肚菌菌丝在液体培养条件下,单位质量的菌丝内C6A8抗原含量不随着菌丝的增长量及培养时间的增加而变化,基本保持恒定,波长450nm处OD值为0.332±0.026;子实体中C6A8抗原含量菌柄高于菌盖,且子实体柄和盖的含量均高于液体培养的营养菌丝中的含量;在出菇阶段,野生羊肚菌出菇点及周围的单位质量土壤基质样本中C6A8抗原含量范围较广,高含量点比出菇点高出近1倍。 展开更多
关键词 羊肚菌菌丝 elisa双抗体夹心法 特异性抗原
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结核DNA疫苗宿主蛋白残留检测方法的建立
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作者 谭奇凤 李婷 +5 位作者 孔雯雯 倪世明 黄明 梁艳 吴雪琼 郭润姿 《海峡药学》 2022年第12期45-48,共4页
目的建立结核DNA疫苗中大肠杆菌宿主蛋白残留量检测的方法。方法采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)建立结核DNA疫苗中宿主蛋白残留量检测的方法,对方法的准确度、专属性、线性范围和耐用性等进行验证,并采用建立的方法对结核DNA疫苗... 目的建立结核DNA疫苗中大肠杆菌宿主蛋白残留量检测的方法。方法采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)建立结核DNA疫苗中宿主蛋白残留量检测的方法,对方法的准确度、专属性、线性范围和耐用性等进行验证,并采用建立的方法对结核DNA疫苗原液进行测定。结果大肠杆菌宿主蛋白含量在2~24ng·L^(-1)范围内,相关系数R 2>0.990,线性关系良好;该法宿主蛋白含量在高中低浓度范围内,回收率在70%~120%之内,准确度良好;该法不易受辅料、核酸、孵育温度和孵育时间影响,专属性和耐用性较好;三批原液的宿主蛋白残留量(HCP)均<1μg·mg^(-1)。结论此方法有较好的准确度、专属性、重复性、中间精密度和耐用性,可用于结核DNA疫苗的宿主蛋白残留量的检测。 展开更多
关键词 宿主蛋白含量 结核DNA疫苗 elisa法 检测
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葡萄球菌肠毒素DAS-ELISA检测方法的建立及应用 被引量：2
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作者 刘鹏翀 黄金海 +3 位作者 刘莉 刘莹 刘壮 孙盈 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第8期195-198,共4页
为筛选特异性强、亲和力高、可夹心配对单克隆抗体4A2和5C12,通过方阵试验优化工作条件,建立金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)的双抗体夹心-酶联免疫吸附试验定量检测方法。结果表明:该方法标准曲线为y=4.074x-1.... 为筛选特异性强、亲和力高、可夹心配对单克隆抗体4A2和5C12,通过方阵试验优化工作条件,建立金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)的双抗体夹心-酶联免疫吸附试验定量检测方法。结果表明:该方法标准曲线为y=4.074x-1.1888,R2=0.9892,检测下限为0.307μg/mL,批内和批间变异系数均小于10%,脱脂乳粉中SEs掺入试验测定回收率为103%～107%,特异性、重复性和稳定性良好;应用所建双抗体夹心-酶联免疫吸附试验方法,对数株葡萄球菌分离株体外培养上清中SEs产生的动态变化进行分析表明,不同菌株SEs分泌能力不同,且0～20h分泌量不断增加,对鲜牛乳和猪淋巴组织匀浆中的SEs进行检测,检出率分别为51.7%和59.1%,并与进口商品化试剂盒检测结果比对,一致率达92.5%,表明食品中SEs污染的普遍存在。所建方法灵敏高效,可为食源性污染监控提供有效手段。 展开更多
关键词 葡萄球菌 葡萄球菌肠毒素 双抗体夹心-酶联免疫吸附法 检测方法
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PTH单克隆抗体的制备与初步应用
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作者 王辉 徐叶 +6 位作者 汪子力 彭惠芳 曾璇 李明勇 刘利辉 王庆林 刘如石 《生命科学研究》 CAS CSCD 2022年第6期509-514,556,共7页
甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)是一种只有84个氨基酸(amino acid,aa)的直链多肽激素,是调节钙磷代谢的主要激素之一。临床上通过测定PTH来评估骨转换、肾脏疾病以及血液透析患者的预后。本研究旨在通过制备抗PTH的单克隆抗体... 甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)是一种只有84个氨基酸(amino acid,aa)的直链多肽激素,是调节钙磷代谢的主要激素之一。临床上通过测定PTH来评估骨转换、肾脏疾病以及血液透析患者的预后。本研究旨在通过制备抗PTH的单克隆抗体建立一种快速检测PTH的方法。首先,以化学合成法合成PTH多肽并将多肽偶联至血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)上,通过皮下注射的方式免疫BALB/c小鼠。其次,经过细胞融合以及杂交瘤细胞的筛选,共获得5株稳定分泌抗PTH的单克隆抗体,并对其进行了制备和纯化。再次,采用方阵棋盘滴定法进行抗体配对筛选,并以9B6和22E8抗体分别作为捕获抗体与酶标抗体,建立了检测PTH的双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay,dsELISA)方法。最后,在保证灵敏度的情况下对所建立的方法进行了工作浓度的优化,该方法的检测灵敏度可达0.14ng/mL;在0.5~8.0 ng/mL的范围内,其R2达到了0.9858,有着较好的线性;其精密度在10%以下,保证了批间的稳定性。综上所述,本研究成功制备了抗PTH的单克隆抗体,建立了PTH的ELISA检测方法,该方法具有良好的线性相关性、准确度和精密度,可用于PTH含量的检测。 展开更多
关键词 甲状旁腺激素(PTH) 杂交瘤细胞 单克隆抗体 双抗体夹心法(dselisa) 检测方法
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血清促红细胞生成素的双抗体夹心ELISA法和ELISA试剂盒的建立及其方法学研究 被引量：1
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作者 曾昭伟 王学谦 +1 位作者 李会强 丁红梅 《实用临床医学（江西）》 CAS 2009年第4期1-4,共4页
目的建立血清促红细胞生成素(EPO)的ELISA试剂盒及一种检测血清EPO的双抗体夹心ELISA方法,并对其临床检测方法学进行研究。方法EPO抗体用缓冲液稀释,150μL/孔滴加到96孔板,用以包被。以正常人血清和临床血清为标本,用ELISA法观察其灵... 目的建立血清促红细胞生成素(EPO)的ELISA试剂盒及一种检测血清EPO的双抗体夹心ELISA方法,并对其临床检测方法学进行研究。方法EPO抗体用缓冲液稀释,150μL/孔滴加到96孔板,用以包被。以正常人血清和临床血清为标本,用ELISA法观察其灵敏度、回收率、线性试验、稳定性。结果最佳包被抗体浓度为1∶600,最佳抗原工作浓度为1∶100,酶标抗体工作浓度为1∶5000。标准曲线的回归方程为:y=0.017x+0.3002,r=0.9710,P<0.05。灵敏度为0.46U/L,高、低浓度样品平均回收率分别为106.74%、104.78%。血清标本20、80U/L批内变异分别为3.044%、7.964%,批间变异分别为1.379%、12.915%。结论双抗体夹心ELISA法检测血清EPO,其敏感性、特异性、准确度均良好,为临床快速、准确、方便检测EPO提供了实验依据。 展开更多
关键词 促红细胞生成素 双抗体夹心elisa法 定量测定 试剂盒
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草鱼肠型点状产气单胞菌双抗夹心ELISA试剂盒的研制
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作者 康洁 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期61-65,共5页
通过对包被单抗和酶标单抗以及抗原最佳工作浓度的优化,建立草鱼肠型点状产气单胞菌双抗夹心ELISA试剂盒检测体系。用分光光度法对检测体系的特异性、稳定性和灵敏度进行测定;用脱脂奶平板法对试剂盒的临床应用进行检测。结果表明,单抗... 通过对包被单抗和酶标单抗以及抗原最佳工作浓度的优化,建立草鱼肠型点状产气单胞菌双抗夹心ELISA试剂盒检测体系。用分光光度法对检测体系的特异性、稳定性和灵敏度进行测定;用脱脂奶平板法对试剂盒的临床应用进行检测。结果表明,单抗最适稀释液为pH9.4的碳酸盐缓冲液,洗涤液为含φ=0.05%Tween-20的PBS,包被单抗最适体积稀释倍数为1∶800,酶标单抗最适体积稀释倍数为1∶6 000,抗原最佳工作浓度为3×104cfu/mL。试剂盒与肠型点状产气单胞菌有特异性反应,脱脂奶平板法与试剂盒法对草鱼患病检出率基本一致,符合率达90%;试剂盒有很好的储存稳定性,检测灵敏度为7×103cfu/mL。 展开更多
关键词 草鱼 肠型点状产气单胞菌 试剂盒 双抗夹心elisa
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