鼠伤寒沙门氏菌hilD基因缺失突变株的构建及其表型分析

1

作者 唐正露 罗聪玉 +1 位作者 曹堃 李郁 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期2748-2755,共8页

为研究鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.T)hilD基因的功能,通过同源重组方法构建S.T hilD基因缺失菌株S.T(ΔhilD),电转化法构建hilD基因回补株S.T(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)、hilD基因缺失株空质粒菌S.T(ΔhilD+pcDNA3.1)和亲本... 为研究鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.T)hilD基因的功能,通过同源重组方法构建S.T hilD基因缺失菌株S.T(ΔhilD),电转化法构建hilD基因回补株S.T(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)、hilD基因缺失株空质粒菌S.T(ΔhilD+pcDNA3.1)和亲本株空质粒菌S.T(pcDNA3.1),进而对S.T(ΔhilD+pcDNA3.1)与S.T(pcDNA3.1)、S.T(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)的表型进行比较。结果显示,S.T(ΔhilD+pcDNA3.1)和S.T(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)遗传性状稳定;三株菌的生长速率无显著差异(P>0.05);S.T(ΔhilD+pcDNA3.1)的生物膜形成能力显著高于S.T(pcDNA3.1)和S.T(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)的(P<0.05);而对于小鼠的致病力及对Hela细胞的黏附力和侵袭力,S.T(ΔhilD+pcDNA3.1)均显著低于S.T(pcDNA3.1)和S.T(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)(P<0.05)。表明S.T hilD基因的缺失不影响其正常生长代谢过程,但毒力减弱。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门氏菌 hilD基因 缺失株 生物学特性

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绿荧光蛋白基因在猪霍乱沙门氏菌C500株asd^-缺失株平衡致死载体系统中的表达 被引量：7

2

作者 徐引弟 郭爱珍 +2 位作者 刘维红 贾爱卿 陈焕春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期493-496,502,共5页

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱用于预防仔猪副伤寒病的弱毒疫苗株,毒力弱且免疫原性良好。为将猪霍乱沙门氏菌开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体并保持原有免疫原性,构建了以C500为亲本菌,用负向选择的重组自杀性质粒介导接合转... 猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱用于预防仔猪副伤寒病的弱毒疫苗株,毒力弱且免疫原性良好。为将猪霍乱沙门氏菌开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体并保持原有免疫原性,构建了以C500为亲本菌,用负向选择的重组自杀性质粒介导接合转移的方法构建了无抗性标记的asd-缺失株。首先构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失1408bp的带有蔗糖敏感基因sacB的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的asd-缺失株,通过PCR鉴定。该缺失株在无外源DAP(二氨基庚二酸)条件下溶菌死亡,它的生长必需外源DAP。PCR扩增绿荧光蛋白突变体4基因,克隆到带有asd基因的原核表达载体pYA3493中,电转化C500asd-缺失株,转化子在LB中生长,并激发强的绿荧光。上述结果表明,该asd-缺失株的构建是成功的,并且可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为开发C500为载体的口服多价疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 猪霍乱沙门氏茵C500株 asd^-缺失株 绿荧光蛋白表达

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伪狂犬病病毒3基因缺失株(SA215)的遗传稳定性研究 被引量：8

3

作者 徐志文 郭万柱 +1 位作者 朱玲 唐善虎 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期694-697,共4页

测定了伪狂犬病病毒Fa株3基因缺失株(SA215)在鸡胚成纤维细胞上连续传代15代次,在非免疫仔猪体内连续传代5代次后,病毒毒价及对易感动物的安全性变化。并以核酸杂交、核酸酶切和gE-ELISA检测技术分别研究了缺失株(SA215)传代后不同代次... 测定了伪狂犬病病毒Fa株3基因缺失株(SA215)在鸡胚成纤维细胞上连续传代15代次,在非免疫仔猪体内连续传代5代次后,病毒毒价及对易感动物的安全性变化。并以核酸杂交、核酸酶切和gE-ELISA检测技术分别研究了缺失株(SA215)传代后不同代次病毒的外源插入基因(LacZ)、缺失基因(TK、gE、gI)遗传变异情况。结果表明缺失株(SA215)毒价及对易感动物安全性未发生变化,外源插入基因得到稳定遗传,缺失基因未见回复突变,证明缺失株(SA215)具有良好遗传稳定性。 展开更多

关键词 代次 伪狂犬病病毒 遗传稳定性 毒价 外源 易感动物 仔猪 SA 基因缺失 缺失基因

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副结核分枝杆菌PanCD基因缺失株的构建及毒力评价

4

作者 姜艳艳 鹿萍 +4 位作者 崔宁 陈凡若 崔莹莹 党光辉 刘思国 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第7期36-42,共7页

为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium sme... 为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msg)感受态细胞中获得噬菌体,并感染MAP K-10菌株,然后挑取单克隆扩大培养,提取基因组进行PCR鉴定;绘制MAP K-10菌株与MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长曲线;用MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠并评价其毒力,解剖取肝脏和脾脏,分析组织荷菌量和肝脏病理变化。结果表明:成功扩增出PanCD基因的上下游同源臂,经PCR扩增和酶切鉴定成功构建出pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,将重组质粒电转化入Msg感受态细胞中获得噬菌体,感染MAP K-10菌株后成功构建出MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株;与MAP K-10菌株相比,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长速率明显下降;攻菌2周时,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠的肝脏和脾脏中荷菌量显著减少;小鼠肝脏病变明显减轻。说明PanCD基因是MAP的一个重要毒力因子,构建的MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株可作为MAP减毒活疫苗的候选菌株。 展开更多

关键词 副结核分枝杆菌 PanCD基因 基因缺失株 毒力评价 减毒活疫苗

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RsbV基因缺失对单核细胞增生李斯特菌毒力的影响 被引量：6

5

作者 张再超 孟庆玲 +5 位作者 乔军 陈创夫 才学鹏 杨丽红 王为升 蔡扩军 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期59-65,共7页

【目的】探讨RsbV基因缺失对单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力的影响。【方法】运用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增出LM-XS5野毒株的RsbV基因缺失片段,然后用同源重组方法构建RsbV基因缺失株;通过肝脾细菌计数、LD50的测定和毒力基因转... 【目的】探讨RsbV基因缺失对单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力的影响。【方法】运用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增出LM-XS5野毒株的RsbV基因缺失片段,然后用同源重组方法构建RsbV基因缺失株;通过肝脾细菌计数、LD50的测定和毒力基因转录水平的检测(qRT-PCR),研究LM野毒株和缺失株在毒力上的差异。【结果】RsbV基因缺失株LD50是野毒株的104倍(P<0.01);缺失株在小白鼠肝和脾内的载菌量均明显减少(P<0.05);实时荧光定量PCR检测结果发现,缺失株4个毒力因子的表达水平均显著低于野毒株(P<0.05);缺失株免疫小白鼠后对野毒株的攻毒具有良好的免疫保护作用。【结论】RsbV对LM的4个毒力基因inlA、LLO、PlcA和PrfA的表达具有调控作用;RsbV基因缺失株毒力明显减弱,但仍保留了较强的免疫原性。 展开更多

关键词 单核细胞增生李斯特菌 RsbV基因缺失株 毒力 同源重组

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基于转录组测序筛选鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失菌的差异表达基因 被引量：5

6

作者 杨阳 杨琦 +6 位作者 董然然 潘永 李晨 刘丽娟 文明 周碧君 王开功 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期2578-2584,共7页

旨在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序中分析适应环境变化及细菌分泌通路,筛选相关基因。通过使用实时荧光定量PCR对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果进行验证,从而对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的细菌趋化性通路、细菌双组... 旨在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序中分析适应环境变化及细菌分泌通路,筛选相关基因。通过使用实时荧光定量PCR对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果进行验证,从而对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的细菌趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路进行深入分析,筛选相关的重要调控基因。结果显示:在细菌趋化性通路中筛选出yiaD、STM 3138、STM 3216和malE等4个共表达基因;在细菌分泌通路中筛选出spaP、invA、prgH、invE、spaS、invG和ssaV等7个共表达基因;在细菌双组分通路中筛选出ybfM、htrA、pagO、STM 3138、STM 3031、ttrB、hilD、pstS、STM 1530、hilA、pgtC、hydH、pocR、STM 3216、ttrR和fljB等16个共表达基因。在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路中筛选出差异表达基因,hfq能够对这些基因进行调控,从而影响如运动性、毒力等相关作用,为沙门菌中的sRNA与hfq后续研究及沙门菌的防治奠定一定基础。 展开更多

关键词 沙门菌 沙门菌hfq基因缺失株 sRNA伴侣蛋白Hfq

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非洲猪瘟病毒多重PMA-qPCR检测方法的建立及应用

7

作者 卓玛 钱炳旭 +2 位作者 吴晓东 戴建君 薛峰 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第4期93-101,共9页

本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特... 本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针,建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示,本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性,与其他常见猪病毒性原无交叉反应;同时,该方法具有较高灵敏度,p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为102copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷,本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时,PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响;对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知,两者的灵敏度均为102copies/μL;将多重PMA-qPCR方法用于23份实际样品检测,结果显示,检测活病毒的准确率为100%,说明该方法能有效区分临床样品中具有感染性的ASFV。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 多重PMA-qPCR 基因缺失株 感染性病毒

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牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株的毒力和免疫保护力评价 被引量：3

8

作者 彭小薇 吴方达 +6 位作者 刘郁夫 董浩 孙永健 毕一鸣 张存瑞 刘林青 韩焘 《中国动物检疫》 CAS 2019年第11期59-64,共6页

为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏... 为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏菌clpP基因缺失后,在细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力显著降低;clpP基因缺失株感染小鼠后,不引起脾脏肿胀,并且在脾脏内的持续期短于A19疫苗株,说明该基因缺失株具有更高的安全性;使用clpP基因缺失株免疫小鼠后,该基因缺失株无法抵御牛种布鲁氏菌2308株和羊种布鲁氏菌M28株的感染。本研究为揭示布鲁氏菌致病机制和新型布病疫苗研发提供了参考。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 疫苗 clpP基因 毒力 基因缺失株 免疫保护

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伪狂犬病毒PK/gG/GFP重组转移载体的构建和表达 被引量：2

9

作者 罗满林 卜春玲 +2 位作者 陈溥言 徐刚 刘镇明 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期64-66,F003,共4页

在构建了含伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)湖北株部分PK基因和gG基因转移载体的基础上,利用平端连接的方法将绿色荧光蛋白(GFP)的基因表达盒插入到缺失的部分,并在下游引入了1个多克隆位点,构建了重组转移载体KGDF.用限制性内切酶... 在构建了含伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)湖北株部分PK基因和gG基因转移载体的基础上,利用平端连接的方法将绿色荧光蛋白(GFP)的基因表达盒插入到缺失的部分,并在下游引入了1个多克隆位点,构建了重组转移载体KGDF.用限制性内切酶鉴定重组转移载体KGDF.根据质粒EGFP C1中的GFP基因序列设计1对引物鉴定GFP表达盒插入的正确性.用脂质体转染试剂盒将KGDF和PRVHB的基因组或病毒共转染BHK 21细胞,在荧光显微镜下将出现病变的荧光斑挑出得到重组病毒.将重组病毒扩大培养后提取基因组鉴定重组病毒中的GFP基因,并通过挑取病变的荧光斑的方法纯化重组病毒. 展开更多

关键词 伪狂犬病毒 基因 转移载体 绿色荧光蛋白 克隆

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猪伪狂犬病病毒ZJ01ΔgI/gE/TK株种子批的免疫原性鉴定 被引量：1

10

作者 姜辰龙 马梓承 +4 位作者 吕林 刘星 白娟 孙杨杨 姜平 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期861-866,共6页

本研究选用30头28~30日龄猪伪狂犬病病毒(PRV)阴性仔猪,随机分为6组,每组5头,第1~5组分别接种F1、F5、F20、F30、F35代次PRV TK/gE/gI基因缺失毒株ZJ01R病毒液,接种剂量为每头106.0 TCID50,第6组为非免疫对照组。接种后第28天用PRV ZJ0... 本研究选用30头28~30日龄猪伪狂犬病病毒(PRV)阴性仔猪,随机分为6组,每组5头,第1~5组分别接种F1、F5、F20、F30、F35代次PRV TK/gE/gI基因缺失毒株ZJ01R病毒液,接种剂量为每头106.0 TCID50,第6组为非免疫对照组。接种后第28天用PRV ZJ01株攻击,结果显示,5个代次疫苗病毒免疫组猪PRV gB血清抗体均为阳性,gE抗体均为阴性,PRV ZJ01特异性中和抗体效价可达1∶32以上。用PRV ZJ01株强毒滴鼻攻击后,非免疫攻毒对照组猪出现严重的临床症状,表现明显的呼吸道症状与神经症状,3/5头猪死亡。5个代次ZJ01R免疫组猪攻毒后均无明显临床症状,脑组织PRV载量均明显低于攻毒对照组(P<0.05),免疫保护效力达100%。证明该疫苗毒株免疫原性稳定,可用于疫苗研制。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 三基因缺失 免疫原性稳定性

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副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的构建及鉴定 被引量：1

11

作者 罗忠永 王印 杨泽晓 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期191-196,共6页

为构建副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株,本研究通过重叠PCR构建了galE基因的上、下游同源臂,然后将其连接到pRE112载体而构建了重组自杀性质粒pRE112ΔgalE;使重组质粒pRE112ΔgalE转化大肠杆菌X7213,与副猪嗜血杆菌接合转移,应用两步法... 为构建副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株,本研究通过重叠PCR构建了galE基因的上、下游同源臂,然后将其连接到pRE112载体而构建了重组自杀性质粒pRE112ΔgalE;使重组质粒pRE112ΔgalE转化大肠杆菌X7213,与副猪嗜血杆菌接合转移,应用两步法筛选galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE,用PCR方法验证galE基因的缺失突变。在此基础上进一步研究galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的生长特性、药物敏感性、对保育猪的毒力等生物学特性。结果,副猪嗜血杆菌血清5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE构建成功,且缺失株的毒力已经被致弱,对药物的敏感性增加。本试验的研究结果为研制更加安全的副猪嗜血杆菌弱毒疫苗提供了实验材料。 展开更多

关键词 副猪嗜血杆菌5型 自杀性质粒pRE112 galE基因缺失株

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鳗弧菌MVAV6203基因缺失株的生物反应器培养及检测

12

作者 杨路 马悦 张元兴 《水产科学》 CAS 北大核心 2007年第4期191-194,共4页

应用摇瓶及30 L生物反应器对鳗弧菌MVAV6203基因缺失株进行培养,通过控制流加速率、改变补料方式及补料基质以优化其培养工艺,并用PCR的方法检测培养所得菌体的aroC基因片段。结果证明:该菌株生长必需添加酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、对... 应用摇瓶及30 L生物反应器对鳗弧菌MVAV6203基因缺失株进行培养,通过控制流加速率、改变补料方式及补料基质以优化其培养工艺,并用PCR的方法检测培养所得菌体的aroC基因片段。结果证明:该菌株生长必需添加酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、对氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸;在生物反应器中菌体最大光密度(OD550)达32.0,对应活菌数为4.6×1010cfu/m l;在培养过程中,菌体不发生基因回复突变。 展开更多

关键词 鳗弧菌 基因缺失株 培养 氨基酸

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伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立 被引量：12

13

作者 兰德松 魏澍 +1 位作者 顾贵波 侯振中 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1137-1141,1156,共6页

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本... 为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 野毒株 gE基因缺失疫苗株 微滴数字PCR 鉴别 定量检测

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伪狂犬病病毒基因缺失疫苗制苗用毒种特性研究 被引量：9

14

作者 陈陆 郭万柱 +1 位作者 殷华平 查光明 《中国病毒学》 CSCD 2005年第2期130-134,共5页

本试验通过对PRV基因缺失株SA215(gE-/gI-/TK- )细胞培养特性、理化特性及形态发生过程进行研究,来确定gE、gI和TK 基因缺失对病毒特性的影响。结果表明,基因缺失对该毒株在培养细胞的吸附和穿入过程没有影响,但与亲本株相比,表现为生... 本试验通过对PRV基因缺失株SA215(gE-/gI-/TK- )细胞培养特性、理化特性及形态发生过程进行研究,来确定gE、gI和TK 基因缺失对病毒特性的影响。结果表明,基因缺失对该毒株在培养细胞的吸附和穿入过程没有影响,但与亲本株相比,表现为生长掩蔽期延长,增殖速度减缓,但能达到相似的增殖滴度,并且基因缺失对病毒的理化特性影响很小。形态发生过程观察结果表明,PRV SA215 株在细胞培养上形态发生正常,能形成感染性病毒粒子,但在由核膜出芽和囊膜形成上受到一定程度的阻碍。本研究为疫苗研制和生产提供指导和依据。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 基因缺失疫苗株 培养特性 理化特性 形态发生

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猪繁殖与呼吸综合征病毒野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法的建立 被引量：9

15

作者 梅林 高英杰 +1 位作者 梁智选 赵建增 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第4期492-494,共3页

目的建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法。方法基于高致病性PRRSV TJ株及其基因缺失致弱疫苗株TJM-F92的nsp2基因序列设... 目的建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法。方法基于高致病性PRRSV TJ株及其基因缺失致弱疫苗株TJM-F92的nsp2基因序列设计1对引物,建立可鉴别不同高致病性PRRSV野毒株与基因双缺失弱毒疫苗株的一步法RT-PCR,并进行特异性、灵敏度、敏感性、重复性验证。结果高致病性PRRSV TJ株扩增出1 100 bp的条带,基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92扩增出740 bp的条带,可对两毒株作出准确鉴别;建立的一步法RT-PCR可测出101TCID50/ml的PRRSV-TJ疫苗毒株,灵敏度较高;对已知阳性和阴性仔猪血清样品的检测结果100%相符,敏感性较高,且重复性较好。结论建立的一步法RT-PCR可用于接种TJM-F92疫苗猪群中PRRSV野毒感染与疫苗免疫猪的临床鉴别,有助于评价疫苗的免疫效果并及早发现野毒感染。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp2基因缺失疫苗株 野毒株 逆转录聚合酶链反应

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伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立 被引量：5

16

作者 兰德松 顾贵波 侯振中 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第7期1804-1812,共9页

为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法... 为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒(PRV) 野毒株 gE基因缺失疫苗株 TaqMan实时荧光定量PCR 鉴别

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伪狂犬病病毒主要毒力基因缺失后的免疫原性研究 被引量：4

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作者 阳爱国 郭万柱 +2 位作者 徐志文 石谦 宋振辉 《西南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2008年第5期943-948,共6页

本试验研究伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失疫苗株D1、D2和D3的免疫原性.对4周龄仔猪按不同剂量分别肌注接种D1、D2、D3后,于7、14d后采血;14d后用107PFU强毒株PRV Fa滴鼻攻毒所有试验猪,攻毒7d后检查PRV在猪体内器官的分布.基因缺失毒株接... 本试验研究伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失疫苗株D1、D2和D3的免疫原性.对4周龄仔猪按不同剂量分别肌注接种D1、D2、D3后,于7、14d后采血;14d后用107PFU强毒株PRV Fa滴鼻攻毒所有试验猪,攻毒7d后检查PRV在猪体内器官的分布.基因缺失毒株接种后试验组仔猪体温略有升高,接种部位未发生炎性反应,不向外散毒.PRV Fa攻毒后试验组的仔猪体温稍有升高但不超过40℃,对照接毒组连续4d均超过40℃、有1头出现明显神经症状并死亡.强毒攻毒后,各剂量免疫组散毒均为2～3d,而对照组、同居猪散毒均为5d.对照组10个器官组织(大脑、小脑、三叉神经、心、肺、肝、肾、淋巴结、脾和扁桃体)均检测出PRV;D1组除大脑、小脑、肺脏外均检测出PRV;D2、D3组除大脑、小脑外,其它均检出PRV.免疫组的保护率均为100%,对照组为75%.试验结果表明D1、D2和D3能对接种猪提供充分的保护;攻毒后疫苗接种猪都向外排毒,但散毒天数均远低于对照组且未从同居感染猪中分离出病毒;D1、D2和D3是具有高度免疫原性且接种安全的基因缺失疫苗株. 展开更多

关键词 伪狂犬病 基因缺失疫苗株 免疫原性

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胸膜肺炎放线杆菌relA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究 被引量：3

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作者 李婷婷 李刚 +4 位作者 刘双红 徐胜奎 李大鹏 王春来 刘伟石 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期969-974,共6页

为探究信号分子4或5磷酸鸟苷[(p)ppGpp]对胸膜肺炎放线杆菌(APP)适应性及致病性影响,本研究以APP血清7型S8为亲本株,通过同源重组、卡那抗性及蔗糖负向筛选的方法,将(p)ppGpp的合成调控基因relA敲除,构建缺失突变株S8△relA。生物学特... 为探究信号分子4或5磷酸鸟苷[(p)ppGpp]对胸膜肺炎放线杆菌(APP)适应性及致病性影响,本研究以APP血清7型S8为亲本株,通过同源重组、卡那抗性及蔗糖负向筛选的方法,将(p)ppGpp的合成调控基因relA敲除,构建缺失突变株S8△relA。生物学特性鉴定结果表明,S8△relA具有良好的遗传稳定性,与亲本株增殖速度变化差异不显著,但平台期营养限制环境下,S8△relA存活能力降低,而且在Gly、Ile、Val营养缺失时,S8△rel生长能力显著抑制;S8△relA的持留菌形成能力、生物膜形成能力以及体外抗肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬能力均有不同程度降低;对小鼠致病性试验结果显示,S8△relA相比亲本株S8毒力降低2.7倍。研究结果表明(p)ppGpp在环境胁迫下参与APP适应性调控,并对其毒力有一定的影响。本研究首次证明了(p)ppGpp作为一种信号分子,同样可以调控APP的生长,并且在宿主肺部弱营养环境条件下,APP与致病力相关的表型均受到影响,这为进一步阐明APP的致病机制提供实验依据。 展开更多

关键词 胸膜肺炎放线杆菌 relA基因 基因缺失株

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伪狂犬病病毒上海株gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的生物学特性初步研究 被引量：2

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作者 姜焱 周斌 陈溥言 《中国病毒学》 CSCD 2004年第6期607-611,共5页

在构建了伪狂犬病病毒上海株的缺失载体 pgEI-GFP 基础上,将 pgEI-GFP 转染感染了 PRV-SH 株的 BHK-21细胞,待出现 80%以上的细胞病变时收获病毒,并以绿色荧光蛋白为标志,通过蚀斑法得到纯化重组病毒gE-/gI-/GFP+ 缺失株。研究了该缺失... 在构建了伪狂犬病病毒上海株的缺失载体 pgEI-GFP 基础上,将 pgEI-GFP 转染感染了 PRV-SH 株的 BHK-21细胞,待出现 80%以上的细胞病变时收获病毒,并以绿色荧光蛋白为标志,通过蚀斑法得到纯化重组病毒gE-/gI-/GFP+ 缺失株。研究了该缺失株的的安全性、在细胞上的生长特性以及对断奶仔猪的安全性、免疫原性等生物学特性。试验结果显示,缺失了 gE-和 gI-后,不影响其在 RK 细胞上的生长状况和病毒的滴度。该疫苗株对小鼠的半数致死量比亲本毒低且对家兔的致死性的时间延长了,这表明该疫苗的毒力比亲本毒有所下降。该缺失株对断奶仔猪安全,无不良接种反应,接种断奶仔猪能抵御高剂量 PRV-SH 株强毒的感染,攻毒后试验猪的发热期、散毒天数均低于对照组。该缺失株接种仔猪后在试验期间一直维持较高水平的中和抗体。 展开更多

关键词 gE^-/gI^-/GFP^+缺失株 生物学特性 中和抗体滴度

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Ⅰ型牛疱疹病毒TK^-/gE^-基因双缺失突变株生物学特性

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作者 定明 范强 +5 位作者 时彦胜 张小飞 张广州 李春 白杰英 刘正飞 《中国比较医学杂志》 CAS 2012年第7期5-8,共4页

目的构建Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)的TK-/gE-双缺失突变株,检测其生物学功能,为治疗牛传染性鼻气管炎提供参考。方法构建了带有EGFP表达盒的BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株。通过southern杂交、蛋白质斑点印迹、空斑试验、MDBK细胞增殖实验等... 目的构建Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)的TK-/gE-双缺失突变株,检测其生物学功能,为治疗牛传染性鼻气管炎提供参考。方法构建了带有EGFP表达盒的BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株。通过southern杂交、蛋白质斑点印迹、空斑试验、MDBK细胞增殖实验等技术方法,对重组基因所构成病毒突变株的生物学特性进行鉴定。结果 Southern杂交及蛋白斑点印迹表明,课题组成功构建了带有EGFP表达盒的双缺失突变株;该突变株具有与野生株相当的繁殖力,但TK-/gE-成功缺失,毒力大幅减弱;BHV-1 TK-/gE-遗传稳定,不会返强。结论本项目组成功构建了Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)的TK-/gE-双缺失突变株,该缺失株具有良好的安全性和稳定性,为该突变株进一步作为生物安全疫苗和多价病毒载体提供了依据,为预防和治疗牛传染性鼻气管炎提供了技术支持。 展开更多

关键词 牛疱疹病毒 TK-/gE-突变株 生物学特性

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