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题名DNA末端硫修饰依赖的体外大片段DNA连接法
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作者
胡媚月
吴更
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机构
上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室
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出处
《微生物学通报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第3期1220-1230,共11页
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基金
国家自然科学基金(31670106)。
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文摘
【背景】DNA组装技术是基因组合成中的一个关键技术。探索低成本、高效率的基因组合成技术一直是合成生物学的重要研究领域。在某些细菌如变铅青链霉菌中,DNA上有磷硫酰化修饰(简称硫修饰),而在另一些细菌如天蓝色链霉菌中存在一种含有硫修饰识别结构域(sulfur-binding domain,SBD)的识别蛋白,可以特异性识别DNA上的硫修饰,这启发了我们发展出一种新的DNA组装技术。【目的】探究在DNA末端硫修饰的连接中,T4 DNA连接酶与SBD相融合蛋白和单独的T4 DNA连接酶相比,是否有更高的连接效率。【方法】根据同源重组原理,设计硫修饰引物,扩增硫修饰的DNA片段。构建T4 DNA连接酶与SBD融合蛋白的3种表达载体T4-linker-SBD(Hga)、T4-linker-SBD(Spr)和T4-linker-SBD(Mmo),表达纯化以上3种融合蛋白。比较3组浓度梯度(2.4、0.24、0.024 mg/mL)T4 DNA连接酶与融合蛋白在2.5 kb和8.0 kb DNA片段连接上的差异。【结果】DNA末端硫修饰的2.5kb和8.0kb的两端片段均能扩增,而且3种融合蛋白均能表达。在两段2.5 kb片段的体外连接实验中,每组T4 DNA连接酶与融合蛋白均能连接成5 kb片段;然而在两段8.0 kb片段的体外连接实验中,相同连接时间和相同酶浓度下,仅融合蛋白T4-linker-SBD(Hga)能够将8.0 kb片段连接成16 kb的长片段。【结论】根据两组琼脂糖凝胶电泳的实验结果可知,在两段8.0 kb的DNA长片段连接实验中,T4-linker-SBD(Hga)融合蛋白具有更高的连接效率。本研究方法以较低的成本和比较高的效率为大片段DNA组装提供了一种新的方法和思路。
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关键词
硫原子识别结构域
dna连接组装
dna硫修饰
基因组合成
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Keywords
sulfur-binding domain(SBD)
dna ligation and assembly
dna sulfur modification
genome synthesis
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分类号
Q78
[生物学—分子生物学]
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题名与DNA硫修饰相关的DndB蛋白纯化体系的建立
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作者
张洪乐
吴更
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机构
上海交通大学生命科学与技术学院/微生物代谢国家重点实验室
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出处
《广东农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第11期157-160,共4页
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基金
国家自然科学基金(30900225
30821005
+2 种基金
90919021)
上海市教育委员会创新项目(09ZZ23)
上海市教育委员会"曙光计划"项目(08SG11)
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文摘
根据DndB蛋白表达载体的特性,建立了一套集Ni2+-NTA亲和层析、Source Q阴离子交换层析和Superdex 200分子筛层析于一体的纯化体系,纯化得到高纯度的DndB蛋白,可用于后续的蛋白质结构生物学和酶学特性研究,为阐明DndB蛋白的功能以及DNA硫修饰的机理打下了良好的基础。
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关键词
dna硫修饰
DndB蛋白
Ni2+-NTA亲和层析
SourceQ阴离子交换层析
Superdex
200分子筛层析
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Keywords
dna sulfur modification
DndB protein
Ni2＋-NTA affinity chromatography
Source Q anion-exchange chromatography
Superdex 200 gel filtration chromatography
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分类号
Q816
[生物学—生物工程]
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