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检测拉米夫定耐药位点基因芯片的研制及其应用初探 被引量:16
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作者 宋家武 林菊生 +1 位作者 孔心涓 梁扩寰 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期83-85,共3页
目的 研发检测拉米夫定耐药的基因芯片进行临床拉米夫定致乙型肝炎病毒 (HBV)耐药相关基因突变的监测。方法  ( 1)将HBVYMDD区 4个突变位点为靶的 16条寡核苷酸探针 ,用GMS 417芯片点样仪固定在经特殊处理的玻片上。待检HBV突变相关... 目的 研发检测拉米夫定耐药的基因芯片进行临床拉米夫定致乙型肝炎病毒 (HBV)耐药相关基因突变的监测。方法  ( 1)将HBVYMDD区 4个突变位点为靶的 16条寡核苷酸探针 ,用GMS 417芯片点样仪固定在经特殊处理的玻片上。待检HBV突变相关的核酸经过聚合酶链反应(PCR)扩增 ,及用Cy5标记的三磷酸脱氧胞苷进行荧光标记 ,再通过与基因芯片杂交 ,严谨洗涤 ,将非突变的标记片段洗脱后 ,将芯片在GeneTACLSIV扫描仪下进行扫描 ,计算机解读。 ( 2 )应用PCR定点突变技术构建Leu5 15Met,Met5 39Ile ,Met5 39Val和V5 42I 4位点和 4位点的单一突变质粒 ,并将芯片检测结果与测序结果对照 ,以鉴定其特异性。同时 ,用血清标本和质粒的重复检测 ,测定其重复性 ,并对 5 0份拉米夫定治疗血清和慢性HBV感染患者血清进行检测。结果 我们研制的芯片能同时特异性地检测耐药相关单一或多位点突变。其检测与测序的符合率 98%。重复率达 96 %~ 10 0 %。结论本研究制作的 4位点基因芯片 ,既可检测乙型肝炎拉米夫定耐药相关单一碱基突变 ,亦可一次有效检出 4个位点的突变 ,且具有快速、高特异性和可重复性 ,检测结果可靠的优点。 展开更多
关键词 拉米夫定 脱氧核糖核酸突变 乙型肝炎病毒 基因芯片 耐药性
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水稻‘日本晴’T-DNA突变体材料纹枯病抗性资源的筛选
2
作者 王艳丽 陈涛 +3 位作者 柴荣耀 张震 王教瑜 孙国昌 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第4期439-443,共5页
从‘日本晴’水稻T-DNA突变体库中挑选出的2 576个株系,首先利用撒施法进行了水稻纹枯病抗性鉴定,发现多数为高感材料,抗病及中抗株系共有36个,中感株系有180个。再利用牙签嵌入法对初筛选出的发病中感以下的216个株系进行进一步抗性鉴... 从‘日本晴’水稻T-DNA突变体库中挑选出的2 576个株系,首先利用撒施法进行了水稻纹枯病抗性鉴定,发现多数为高感材料,抗病及中抗株系共有36个,中感株系有180个。再利用牙签嵌入法对初筛选出的发病中感以下的216个株系进行进一步抗性鉴定,发现18个株系抗性表现较好;并在温室中利用微室法对这18个株系进行了进一步抗性鉴定,结果表明株系间抗性差异不显著,但其中14个株系抗性与野生亲本‘日本晴’差异显著(P<0.01)。 展开更多
关键词 水稻纹枯病 立枯丝核菌 T-dna突变体 抗性资源
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水稻DNA损伤修复同源基因纯合突变系的鉴定 被引量:3
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作者 李瑞清 富昊伟 +2 位作者 崔海瑞 张华丽 舒庆尧 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期409-415,共7页
在长期的进化过程中,生物逐步形成了应对各种DNA损伤的修复机制,以保护基因组的完整性,减轻或消除DNA损伤的影响。本研究通过同源搜索找到了与DNA损伤修复相关水稻同源基因,在水稻插入突变体库中搜索出插入突变系,并成功引进了其中的26... 在长期的进化过程中,生物逐步形成了应对各种DNA损伤的修复机制,以保护基因组的完整性,减轻或消除DNA损伤的影响。本研究通过同源搜索找到了与DNA损伤修复相关水稻同源基因,在水稻插入突变体库中搜索出插入突变系,并成功引进了其中的26份T1代突变材料。通过对插入位点的分子鉴定和进一步培育,获得了14份涉及8个水稻DNA损伤修复同源基因的T3代纯合插入突变系,并对其进行了初步的遗传分析和表型考察。这些纯合突变系涉及的水稻基因可能在DNA错配修复(Os02g0592300、Os09g0407600、Os10g0509000)和碱基切除修复(Os02g0465112、Os06g0643600、Os05g0567500、Os04g0673400、Os09g0420300)中发挥重要作用。与亲本相比,除1份材料外,其他纯合突变体系及其野生型姐妹系的结实率均有显著降低;某些纯合突变系的千粒重与亲本相比有显著下降。这些水稻DNA损伤修复基因突变系的育成为开展水稻DNA修复的遗传学和分子生物学研究以及培育抗逆水稻提供了珍贵的实验材料。 展开更多
关键词 水稻 T-dna突变系 Tos17突变系 dna损伤修复
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隐球酵母vps41Δ菌株转化条件优化及突变体库构建
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作者 宋瑛瑾 刘晓光 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期151-155,共5页
新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是一种重要的条件致病性真菌。前期试验证实VPS41基因参与隐球酵母的氮源饥饿应答反应并影响其致病性。系统研究了影响农杆菌介导的vps41Δ饥饿应答缺陷型菌株关键因素,并利用优化的农杆菌转化体... 新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是一种重要的条件致病性真菌。前期试验证实VPS41基因参与隐球酵母的氮源饥饿应答反应并影响其致病性。系统研究了影响农杆菌介导的vps41Δ饥饿应答缺陷型菌株关键因素,并利用优化的农杆菌转化体系构建了包含5 000多个转化子的vps41Δ菌株的T-DNA插入突变体库,为下一步筛选鉴定隐球酵母VPS41饥饿应答信号通路中的其他相关基因提供了基础材料。 展开更多
关键词 新型隐球酵母 根瘤农杆菌 vps41Δ T-dna 突变体库
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灰葡萄孢分生孢子产生相关基因的克隆及功能分析 被引量:8
5
作者 王璇 邢继红 +2 位作者 赵斌 韩建民 董金皋 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期533-543,共11页
【目的】克隆灰葡萄孢分生孢子产生相关基因,并研究其功能,为进一步研究灰葡萄孢分生孢子产生机理和灰葡萄孢侵染及致病机理奠定基础。【方法】通过筛选灰葡萄孢ATMT突变体库,获得一株不能产生分生孢子的突变菌株BCt78,采用PCR和Souther... 【目的】克隆灰葡萄孢分生孢子产生相关基因,并研究其功能,为进一步研究灰葡萄孢分生孢子产生机理和灰葡萄孢侵染及致病机理奠定基础。【方法】通过筛选灰葡萄孢ATMT突变体库,获得一株不能产生分生孢子的突变菌株BCt78,采用PCR和SouthernBlotting技术,对突变菌株BCt78进行分子鉴定。利用TAIL-PCR技术获得T-DNA插入位点的侧翼序列;将所获得侧翼序列与灰葡萄孢基因组数据库中的已知基因序列进行BLAST分析,推测出T-DNA的插入位点;通过PCR进一步验证T-DNA的插入位点,利用RT-PCR技术确定突变基因;最后对突变菌株的菌落形态、生长速度、胞壁降解酶活力、粗毒素的生物活性、对番茄叶片的致病能力及部分致病相关基因的表达情况进行研究。【结果】TAIL-PCR结果证实T-DNA插入到灰葡萄孢BC1G_12707.1基因的ATG起始密码子区;RT-PCR结果证实突变基因为BC1G_12707.1,该基因DNA全长为135 bp,编码一个44个氨基酸的假定蛋白(Hypothetical protein)。突变菌株在PDA培养基上菌落呈灰白色,生长速度减慢,不能产生分生孢子及菌核;对番茄叶片的致病性增强,且胞壁降解酶(PG、PMG和Cx)活力增强;突变菌株中参与细胞壁降解的角质酶基因cutA和多聚半乳糖醛酸酶基因Bcpg1,信号转导途径基因(PKA1、PKA2、Bac、Bmp3),产毒素基因BcBOT2(Sesquiterpene synthase),漆酶基因Lac1,跨膜蛋白基因Btp1表达都增强。【结论】BC1G_12707.1基因在灰葡萄孢分生孢子产生、菌核形成及致病力等方面起重要作用。 展开更多
关键词 灰葡萄孢 T-dna插入突变体 TAIL-PCR 孢子发育
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尖镰孢古巴专化型4号小种T-DNA插入突变体Focr4-1562及其基因敲除子的生物学表型研究 被引量:8
6
作者 吴飞宏 曾涛 +2 位作者 陈汉清 曾会才 彭明 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期584-592,共9页
尖镰孢古巴专化型4号小种Fusarium oxysporumf.sp.cubenserace4(Focr4)是引起毁灭性土传病害香蕉枯萎病的危害性最大的小种,至今其致病机理尚不清楚。对已获得的野生型菌株Focr4-193-6经基因T-DNA插入引起致病性严重减弱的突变体Focr4-1... 尖镰孢古巴专化型4号小种Fusarium oxysporumf.sp.cubenserace4(Focr4)是引起毁灭性土传病害香蕉枯萎病的危害性最大的小种,至今其致病机理尚不清楚。对已获得的野生型菌株Focr4-193-6经基因T-DNA插入引起致病性严重减弱的突变体Focr4-1562及其插入失活基因的敲除子△Focr4-1562的生物学表型进行了研究。玻璃纸穿透试验、活体叶片接种及根部接种致病性测定的结果表明,插入突变体和敲除子不能穿透玻璃纸生长,叶片接种和根部接种未见有明显病斑和球茎维管束变褐症状;野生型菌株则能穿透玻璃纸生长,叶片接种部位表现明显症状,被接种根部和球茎的维管束表现变褐症状。T-DNA插入突变体Focr4-1562和其基因敲除子△Focr4-1562的致病性表型一致,初步鉴定为致病性严重减弱。营养生长及形态学观察结果表明,野生型、插入突变体及其敲除子的最适生长温度均在28℃,最适的生长pH值为7.0-8.0之间,插入突变体及其敲除子的孢子形态与野生型Focr4-193-6相比并没有显著的变化,但敲除子△Focr4-1562的产孢量降低,插入突变体及其敲除子对细胞壁降解酶的抗性大大增强,说明被敲除的致病相关基因与Focr4-193-6分生孢子产生及细胞壁的形成有关。 展开更多
关键词 香蕉枯萎病 T-dna 插入突变体 基因敲除 生物学特性
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T-DNA插入筛选棉花枯萎病菌致病力减弱突变体及其侧翼序列分析
7
作者 何丹 苏飞鸿 +3 位作者 张李娅 宋东博 夏红飞 顾爱星 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1732-1740,共9页
【背景】新疆是棉花生产的主要地区,枯萎病的发生严重影响着棉花的产量。目前,关于棉花枯萎病原菌的发病机制尚无详细报道。【目的】在尖孢镰刀菌突变体库中筛选出致病力降低的突变体并分析其致病基因,以阐明棉花枯萎病菌的致病分子机... 【背景】新疆是棉花生产的主要地区,枯萎病的发生严重影响着棉花的产量。目前,关于棉花枯萎病原菌的发病机制尚无详细报道。【目的】在尖孢镰刀菌突变体库中筛选出致病力降低的突变体并分析其致病基因,以阐明棉花枯萎病菌的致病分子机制。【方法】在前期已建立的枯萎病菌突变体库的基础上,对随机挑选的136份突变体致病力进行鉴定,并对其表型和侧翼序列进行分析。【结果】获得5个致病能力明显降低的突变株,突变体B-18的形态与野生型有差异且菌落颜色变为紫色;5个突变体生长速率均降低,其中B-18下降最明显;5个突变体产孢数量均降低。扩增5个突变体,测序后经BLAST比对分析,确定了T-DNA在枯萎病菌基因组的分布情况。【结论】对筛选出的5个致病力缺陷的突变体进行分析并找到致病基因,为研究棉花致病基因的功能和克隆提供了坚实的理论基础。 展开更多
关键词 棉花 尖孢镰刀菌 T-dna插入突变体 高效热不对称交错PCR 致病力
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稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆 被引量:5
8
作者 黄磊 俞咪娜 +5 位作者 胡建坤 于俊杰 尹小乐 聂亚锋 陈志谊 刘永锋 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第16期3344-3353,共10页
【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制... 【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降,产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现,T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处,半定量PCR结果表明,Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因,推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。 展开更多
关键词 稻曲病菌 T-dna插入突变 致病力 基因克隆
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利用核酸适配体封闭Tth DNA聚合酶突变体实现温启动一步法RT-qPCR 被引量:1
9
作者 张雅琪 张建 +4 位作者 唐雨婷 黄庆媛 季璐 卢辰 罗志丹 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期51-58,共8页
目的:Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶。为消除其在一步法逆转录-实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative real-time PCR,RT-qPCR)反应时的非特异性扩增,筛选可在较低温度下抑制其活性... 目的:Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶。为消除其在一步法逆转录-实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative real-time PCR,RT-qPCR)反应时的非特异性扩增,筛选可在较低温度下抑制其活性的核酸适配体,从而实现温启动一步法RT-qPCR。方法:在前期获得不依赖Mn2+的Tth DNA聚合酶突变体的基础上,检验四种DNA适配体及其对应的RNA适配体对Tth DNA聚合酶突变体的DNA聚合酶活性和逆转录酶活性的封闭效果以及解离温度,并通过分子对接模拟适配体与聚合酶的结合模式。结果:TQ21-11和TQ21-11-RNA两种适配体在40℃可有效抑制Tth DNA聚合酶的DNA聚合酶活性和逆转录酶活性,抑制率达到97%以上;两种适配体在50℃可几乎完全解离。这两种适配体均可用于温启动一步法RT-qPCR,其中TQ21-11-RNA的非特异性扩增更低。结论:利用TQ21-11和TQ21-11-RNA两种适配体在室温下封闭Tth DNA聚合酶突变体活性,可以实现温启动一步法RT-qPCR。 展开更多
关键词 核酸适配体 Tth dna聚合酶突变体 温启动 一步法RT-qPCR
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Effort and Contribution of T-DNA Insertion Mutant Library for Rice Functional Genomics Research in China:Review and Perspective 被引量:4
10
作者 Yuxiao Chang Tuan Long Changyin Wu 《Journal of Integrative Plant Biology》 SCIE CAS CSCD 2012年第12期953-966,共14页
With the completion of the rice (Oryza sativa L.) genome-sequencing project, the rice research community proposed to characterize the func- tion of every predicted gene in rice by 2020. One of the most effective and... With the completion of the rice (Oryza sativa L.) genome-sequencing project, the rice research community proposed to characterize the func- tion of every predicted gene in rice by 2020. One of the most effective and high-throughput strategies for studying gene function is to employ genetic mutations induced by insertion elements such as T-DNA or transposons. Since 1999, with support from the Ministry of Science and Technology of China for Rice Functional Genomics Programs, large-scale T-DNA insertion mutant populations have been generated in Huazhong Agricultural University, the Chinese Academy of Sciences and the Chinese Academy of Agricultural Sciences. Currently, a total of 372,346 mutant lines have been generated, and 58,226 T-DNA or Tos17 flanking sequence tags have been isolated. Using these mutant resources, more than 40 genes with potential applications in rice breeding have already been identified. These include genes involved in biotic or abiotic stress responses, nutrient metabolism, pollen development, and plant architecture. The functional analysis of these genes will not only deepen our understanding of the fundamental biological questions in rice, but will also offer valuable gene resources for developing Green Super Rice that is high-yielding with few inputs even under the poor growth conditions of many regions of Africa and Asia. 展开更多
关键词 Flanking sequence tags functional genomics insertion site RICE T-dna insertion mutant library.
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拟南芥与大豆疫霉菌的非寄主互作及一个感病突变体的遗传分析 被引量:1
11
作者 刘秋萍 曹华 +4 位作者 姚茂金 马英 邓斌生 权军利 单卫星 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期548-555,共8页
非寄主抗病性是一种普遍的自然现象,该文通过建立拟南芥-大豆疫霉菌(Arabidopsis thaliana-Phytophthora sojae)非寄主互作系统,筛选对大豆疫霉菌感病的拟南芥突变体,为研究植物对卵菌的非寄主抗病性遗传机制奠定基础。以大豆疫霉菌游... 非寄主抗病性是一种普遍的自然现象,该文通过建立拟南芥-大豆疫霉菌(Arabidopsis thaliana-Phytophthora sojae)非寄主互作系统,筛选对大豆疫霉菌感病的拟南芥突变体,为研究植物对卵菌的非寄主抗病性遗传机制奠定基础。以大豆疫霉菌游动孢子接种拟南芥T-DNA插入突变体离体叶片,从代表12000个独立转化株系的40000株T3代T-DNA插入拟南芥突变体中获得一系列对大豆疫霉菌感病的突变体。其中突变体581-51感病性状表现稳定,离体叶片接菌后3天内出现明显的水渍状病斑,4-5天后产生大量卵孢子和/或孢子囊。细胞学观察发现有典型的吸器形成。Southern杂交和遗传分析结果表明,581-51突变体含有4个T-DNA插入事件,其感病性状可能由隐性单基因控制。 展开更多
关键词 拟南芥 非寄主抗病性 卵菌 大豆疫霉菌 T-dna插入突变体
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稻曲病菌T-DNA插入突变体B1464插入位点分析 被引量:2
12
作者 王亚会 刘永锋 +5 位作者 陆凡 俞咪娜 黄磊 郑梦婷 于俊杰 尹小乐 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期311-318,共8页
以稻曲病菌致病力丧失的突变菌株B1464为材料,对其生物学形态和分子遗传变异进行分析。B1464田间接种表现为不致病,与野生型菌株相比,在营养贫瘠的MM培养基上生长速率没有显著差异,而在PSA和TB3培养基中生长速率较慢,并且在PS液体培养... 以稻曲病菌致病力丧失的突变菌株B1464为材料,对其生物学形态和分子遗传变异进行分析。B1464田间接种表现为不致病,与野生型菌株相比,在营养贫瘠的MM培养基上生长速率没有显著差异,而在PSA和TB3培养基中生长速率较慢,并且在PS液体培养基中产孢能力下降,同时突变菌株的分生孢子与野生型相比形态和大小均发生变化。Southern杂交结果显示T-DNA在突变菌株B1464中以单拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增得到的紧邻T-DNA两侧的侧翼序列在野生型中不相邻,与野生型菌株基因组比对发现突变菌株插入位点处丢失约20kb的DNA片段。RT-PCR结果表明突变菌株中T-DNA插入位点两侧基因表达量均下调。推断突变菌株B1464的致病能力丧失可能是由于T-DNA的插入导致了染色体重排及破坏了某些基因的正常表达。 展开更多
关键词 稻曲病菌 T-dna 插入突变 致病力 苹果酸合成酶 铜转运蛋白
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稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析 被引量:1
13
作者 丁慧 俞咪娜 +5 位作者 王亚会 于俊杰 尹小乐 薄惠文 黄星 刘永锋 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期541-551,共11页
以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2... 以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。 展开更多
关键词 稻曲病菌 T-dna插入突变 ATMT转化 致病力 侧翼序列
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灰葡萄孢菌核发育相关基因的功能分析 被引量:1
14
作者 司贺龙 赵斌 +3 位作者 赵福鑫 邢继红 韩建民 董金皋 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2014年第2期80-84,共5页
从灰葡萄孢ATMT突变体库中筛选获得一株不产生菌核的突变体,并利用TAIL-PCR技术获得插入位点的侧翼序列,将其在灰葡萄孢基因组数据库中进行Blast比对分析,采用分子生物学技术,对突变菌株BMH174鉴定并获得其突变基因(BC1G_06945.1);并对... 从灰葡萄孢ATMT突变体库中筛选获得一株不产生菌核的突变体,并利用TAIL-PCR技术获得插入位点的侧翼序列,将其在灰葡萄孢基因组数据库中进行Blast比对分析,采用分子生物学技术,对突变菌株BMH174鉴定并获得其突变基因(BC1G_06945.1);并对突变体的形态学、生长速率、分生孢子产量、致病能力、胞壁降解酶活力、毒素的生物学活性等方面进行了研究,这将为深入了解灰葡萄孢的致病机制奠定基础。 展开更多
关键词 灰葡萄孢 T-dna插入突变体 TAIL-PCR
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甜瓜T-DNA插入突变体的构建
15
作者 许荣华 姜陆 +1 位作者 宁雪飞 李冠 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1048-1053,共6页
【目的】构建激活标签载体并将其转入甜瓜中,获得甜瓜T-DNA插入突变体,为甜瓜功能基因组学的研究奠定基础。【方法】用PCR法扩增目的 DNA片段,经EcoRI和Sac I顺序酶切,将目的片段连接到p CAMBIA2301载体上,构建含4×35s Enhancer DN... 【目的】构建激活标签载体并将其转入甜瓜中,获得甜瓜T-DNA插入突变体,为甜瓜功能基因组学的研究奠定基础。【方法】用PCR法扩增目的 DNA片段,经EcoRI和Sac I顺序酶切,将目的片段连接到p CAMBIA2301载体上,构建含4×35s Enhancer DNA片段的激活标签载体。以甜瓜品种‘伽师’为材料,利用农杆菌介导的转化体系转化甜瓜愈伤组织,获得甜瓜T-DNA插入突变体。【结果】获得4株T0代甜瓜转化幼苗,通过Kan筛选和PCR鉴定甜瓜转化幼苗的DNA中是否含有目的基因,证明其中3株甜瓜转化幼苗为转基因植株。【结论】获得了突变植株,为甜瓜重要性状基因发掘奠定基础。 展开更多
关键词 甜瓜 激活标签 T-dna插入突变体
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棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体功能基因及生物学性状分析
16
作者 蔡节 罗秀媚 +2 位作者 陈姗姗 谢成建 杨星勇 《重庆师范大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期107-113,共7页
【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过ATMT法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个T-DNA插入突变体。利用hiTAIL-PCR技术获得17株T-DNA插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16... 【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过ATMT法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个T-DNA插入突变体。利用hiTAIL-PCR技术获得17株T-DNA插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株Vd991相比,出现黄色菌丝型2株,中间菌丝型6株;部分突变体在生长速率(7株)、产孢量(14株)和粗毒素产量(4株)上都发生了具有统计学意义的变化(p<0.05);致病力测定表明,9株突变体的致病力较野生型有所降低,在p<0.05水平具有统计学意义。【结论】该研究为大丽轮枝菌致病基因的筛选和鉴定提供了理论基础。 展开更多
关键词 棉花黄萎病 大丽轮枝菌 T-dna插入突变 生物学性状 基因功能
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一株灰葡萄孢细胞壁完整性缺陷突变株的分子鉴定和表型分析
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作者 张为宏 朱廷恒 +1 位作者 汪琨 崔志峰 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第4期630-636,共7页
为探明灰葡萄孢细胞壁相关基因功能,用荧光增白剂Calcofluor White(CFW)从灰葡萄孢T-DNA插入突变体库中筛选细胞壁完整性缺陷突变株,发现一株突变株D-59对CFW的敏感性与野生型相比提高了2.8倍。通过TAIL-PCR扩增突变株的T-DNA插入位点... 为探明灰葡萄孢细胞壁相关基因功能,用荧光增白剂Calcofluor White(CFW)从灰葡萄孢T-DNA插入突变体库中筛选细胞壁完整性缺陷突变株,发现一株突变株D-59对CFW的敏感性与野生型相比提高了2.8倍。通过TAIL-PCR扩增突变株的T-DNA插入位点的侧翼序列并对其进行序列分析表明,T-DNA插入于突变株BC1G_00770.1基因的外显子部位。RT-PCR的结果显示,D-59的BC1G_00770.1基因不表达。突变株D-59的表型分析表明,突变株的菌丝稀疏,菌落呈土黄色,产孢量明显下降,孢子萌发异常,致病能力减弱,细胞壁的几丁质含量下降了48%。 展开更多
关键词 灰葡萄孢 细胞壁缺陷 T-dna插入突变体 TAIL-PCR
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灰葡萄孢T-DNA插入细胞壁缺陷突变体的筛选
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作者 雷娜 张为宏 +2 位作者 朱廷恒 汪琨 崔志峰 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第4期754-758,共5页
用荧光增白剂Calcofluor White(CFW)对234株T-DNA插入灰葡萄孢突变株进行筛选,获得了3株对CFW敏感性(B-117,B-169,D-9)和1株对CFW抗性(B-62)的突变株。1.2 mol.L-1Sorbito对D-9的生长缓慢有挽救作用。在SDS培养基上D-9和野生型的差异不... 用荧光增白剂Calcofluor White(CFW)对234株T-DNA插入灰葡萄孢突变株进行筛选,获得了3株对CFW敏感性(B-117,B-169,D-9)和1株对CFW抗性(B-62)的突变株。1.2 mol.L-1Sorbito对D-9的生长缓慢有挽救作用。在SDS培养基上D-9和野生型的差异不大,但在NaCl培养基上野生型的生长受到抑制,D-9则不受NaCl影响。在孢子萌发试验中,D-9突变株也与野生型明显不同,表现为D-9的孢子膨大、菌丝较粗、长度增加而且不弯曲。在番茄感染试验中,D-9突变株侵染番茄的毒力大幅度减弱。由此推测D-9突变株与细胞壁缺损以及致病性有关。 展开更多
关键词 灰葡萄孢 T-dna插入突变体 CFW敏感性 细胞壁缺陷
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水稻抗白叶枯病T-DNA插入突变体侧翼序列的分离和分析
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作者 乔枫 赵开军 +1 位作者 耿贵工 陈志 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期1-7,共7页
采用PCR-walking方法对水稻抗白叶枯病突变体G48的侧翼序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了该突变体T-DNA左、右边界侧翼序列,确定T-DNA插入水稻日本晴第三染色体clone OSJNBa0076E06(AC132215.1)位点上,左、右... 采用PCR-walking方法对水稻抗白叶枯病突变体G48的侧翼序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了该突变体T-DNA左、右边界侧翼序列,确定T-DNA插入水稻日本晴第三染色体clone OSJNBa0076E06(AC132215.1)位点上,左、右边界插入位点分别位于该克隆的第93 750、93 824碱基处。PCR-walking方法为T-DNA的侧翼序列分析提供了一种简单、高效的方法。 展开更多
关键词 T-dna插入突变体 水稻 PCR-walking 侧翼序列
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黑曲霉纤维素酶突变子T-DNA插入位点的遗传分析及性质鉴定
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作者 黄文 杨洪江 秦慧彬 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期60-64,共5页
采用羧甲基纤维素钠筛选培养基,对黑曲霉(Aspergillus niger)T-DNA突变子文库进行筛选,分离到一株纤维素酶分泌水平较低的菌株AN-108,为野生型菌株的83.3%。进一步测定该突变子固体发酵的纤维素酶活力,与野生型菌株相比没有明显差别,推... 采用羧甲基纤维素钠筛选培养基,对黑曲霉(Aspergillus niger)T-DNA突变子文库进行筛选,分离到一株纤维素酶分泌水平较低的菌株AN-108,为野生型菌株的83.3%。进一步测定该突变子固体发酵的纤维素酶活力,与野生型菌株相比没有明显差别,推测与固体发酵培养基中含有的天然糖类有关。在添加不同糖类的CMC-Na平板上培养该突变子,菌落周围均出现较明显的水解圈,结果显示糖类可能作为诱导物克服突变带来的影响。为了确定突变子AN-108中何种基因被阻断,采用反向PCR方法分析了T-DNA插入位点的序列,获得序列经过比对分析发现,该序列与黑曲霉An14g03730同源程度达90%,编码富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein,PRP)。 展开更多
关键词 黑曲霉 T-dna插入突变子文库 反向PCR
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