苏氨酸醛缩酶的研究进展 被引量：2

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作者 黎军 张志雄 +1 位作者 杨金亮 李学英 《生物技术通讯》 CAS 2019年第3期442-448,共7页

苏氨酸醛缩酶(TAs)以磷酸吡哆醛为辅酶,催化不同的醛与α-氨基酸发生醇醛缩合反应,形成具有2个手性中心的β-羟基-α-氨基酸。TAs在不对称催化过程中可以控制产物α-碳位的立体构型,而对β-碳位的立体构型控制相对较弱。增强TAs在β-碳... 苏氨酸醛缩酶(TAs)以磷酸吡哆醛为辅酶,催化不同的醛与α-氨基酸发生醇醛缩合反应,形成具有2个手性中心的β-羟基-α-氨基酸。TAs在不对称催化过程中可以控制产物α-碳位的立体构型,而对β-碳位的立体构型控制相对较弱。增强TAs在β-碳位的立体选择性是近年来研究TAs不对称催化的热点。本文重点阐述了TAs的结构与作用机制、定向进化,以及在生物催化合成中的应用,对TAs的研究与开发进行了展望。 展开更多

关键词 苏氨酸醛缩酶 L-苏氨酸醛缩酶 D-苏氨酸醛缩酶 β-羟基-α-氨基酸

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苏氨酸醛缩酶的结构与功能及其在药物合成中的应用

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作者 何远志 冯雁 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2023年第5期962-977,共16页

β-羟基-α-氨基酸(β-hydroxy-α-amnio acids,HAAs)是一类广泛应用于制药工业的重要手性中间体。由于其含有双手性中心(C_(α)和C_(β)),探索其严格立体选择性的生物合成方法备受关注。苏氨酸醛缩酶(threonine aldolase,TA)可在温和... β-羟基-α-氨基酸(β-hydroxy-α-amnio acids,HAAs)是一类广泛应用于制药工业的重要手性中间体。由于其含有双手性中心(C_(α)和C_(β)),探索其严格立体选择性的生物合成方法备受关注。苏氨酸醛缩酶(threonine aldolase,TA)可在温和条件下催化不同类型的醛与氨基酸缩合构筑丰富的HAAs产物库,显示了工业应用潜力。由于目前表征的TA普遍存在对Cβ立体选择性不严格、活性较低以及催化机制不清晰等问题,为其在HAAs合成中的应用带来了挑战。本文综述了TA在新酶挖掘、结构与催化机理解析、蛋白质工程以及合成应用等方面的研究进展,为推动酶催化绿色、高效合成手性药物提供参考。 展开更多

关键词 苏氨酸醛缩酶 β-羟基-α-氨基酸 晶体结构 立体选择性 蛋白质工程

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外源肌酸对团头鲂生长性能、肠道菌群及血清氨基酸含量的影响 被引量：3

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作者 滑艺卓 王凡 +1 位作者 李军涛 赵玉华 《饲料研究》 CAS 北大核心 2021年第22期46-51,共6页

试验旨在研究高糖条件下,含有1.20%甜菜碱的饵料中补充0.50%肌酸对团头鲂(Megalobrama amblycephala)生长性能、肠道菌群及血清氨基酸含量的影响。选择180尾平均体重为(11.88±0.46) g的团头鲂,随机分为2组,每组3个重复,每个重复30... 试验旨在研究高糖条件下,含有1.20%甜菜碱的饵料中补充0.50%肌酸对团头鲂(Megalobrama amblycephala)生长性能、肠道菌群及血清氨基酸含量的影响。选择180尾平均体重为(11.88±0.46) g的团头鲂,随机分为2组,每组3个重复,每个重复30尾鱼。对照组饵料中包含39.76%碳水化合物+1.20%甜菜碱,不含肌酸;试验组饵料含39.29%碳水化合物+1.20%甜菜碱+0.50%肌酸。试验期90 d。结果表明,与对照组相比,试验组团头鲂的饵料系数显著降低(P<0.05);试验组团头鲂肠道梭杆菌门和变形菌门的占比均显著降低(P<0.05),厚壁菌门占比显著升高(P<0.05);试验组团头鲂肠道的鲸杆菌属、气单胞菌属和弧菌属占比显著降低(P<0.05),ZOR0006和丹毒丝菌科未命名属占比显著升高(P<0.05);试验组团头鲂的血清苏氨酸(Thr)含量显著上升(P<0.05);试验组团头鲂的CK mRNA的表达量显著上升(P<0.05),Tha1 mRNA表达量显著升高(P<0.05)。研究表明,含有1.2%甜菜碱的高糖饵料中补充0.50%的肌酸能够提高团头鲂的饵料利用率,改善其肠道微生物组成及健康,通过苏氨酸醛缩酶增加血清苏氨酸含量。 展开更多

关键词 高糖饲料 肌酸 团头鲂 肠道微生物 苏氨酸醛缩酶 苏氨酸

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棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因GarTHA的克隆及功能验证 被引量：2

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作者 范昕琦 刘章伟 +3 位作者 冯娟 徐鹏 张香桂 沈新莲 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1962-1969,共8页

盐胁迫是影响作物生长和发育的重要因素之一。一些棉属野生种具有较好的耐盐性,是开展棉花耐盐性机制研究以及改良陆地棉耐盐性的重要资源。本研究基于cDNA-AFLP技术分离获得的旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫下差异表达片段序列信息,... 盐胁迫是影响作物生长和发育的重要因素之一。一些棉属野生种具有较好的耐盐性,是开展棉花耐盐性机制研究以及改良陆地棉耐盐性的重要资源。本研究基于cDNA-AFLP技术分离获得的旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫下差异表达片段序列信息,经电子克隆技术和RT-PCR方法克隆了旱地棉苏氨酸醛缩酶基因cDNA全长,命名为GarTHA(GenBank登录号为KC167360)。该cDNA全长为1018 bp,包含一个822 bp的完整ORF,编码273个氨基酸残基,蛋白质分子量为82.57 kD,等电点为4.89。GarTHA基因与杨树PtTHA基因同源性最高,为84.6%。为进一步验证其功能,利用拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体,将GarTHA基因的完整ORF转入拟南芥中,获得转基因植株并进行了耐盐性鉴定。结果表明,在盐胁迫下转基因拟南芥种子的发芽率明显高于野生型,且转基因植株的根长显著高于野生型。说明GarTHA基因可能参与植物的盐胁迫反应,从而提高植物抗逆性。 展开更多

关键词 旱地棉 苏氨酸醛缩酶 耐盐性 结构特征 功能分析

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苏氨酸醛缩酶的催化机理、分子改造及合成应用 被引量：2

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作者 陈启佳 陈曦 +1 位作者 郝建雄 朱敦明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期4215-4230,共16页

苏氨酸醛缩酶催化醛和甘氨酸羟醛缩合,一步反应即可构建产物β-羟基-α-氨基酸的两个手性中心,从原子经济性和环境影响角度,是非常具有潜力的绿色合成光学纯β-羟基-α-氨基酸的方式之一。多个不同生物来源的苏氨酸醛缩酶得到分离和表征... 苏氨酸醛缩酶催化醛和甘氨酸羟醛缩合,一步反应即可构建产物β-羟基-α-氨基酸的两个手性中心,从原子经济性和环境影响角度,是非常具有潜力的绿色合成光学纯β-羟基-α-氨基酸的方式之一。多个不同生物来源的苏氨酸醛缩酶得到分离和表征,较低的β-碳立体选择性以及反应过程中动力学和热力学控制难题,使其在合成应用中面临很大挑战。文中综述了近年来苏氨酸醛缩酶在基因挖掘、催化机理、高通量筛选与分子改造、合成应用等方面的研究进展,旨在为进一步研究提供参考。 展开更多

关键词 L-苏氨酸醛缩酶 D-苏氨酸醛缩酶 β-羟基-α-氨基酸 催化机理 分子改造

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L-苏氨酸醛缩酶:C-C键手性合成的绿色催化剂

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作者 郑文隆 徐刚 +1 位作者 杨立荣 吴坚平 《生物加工过程》 CAS 2023年第5期521-531,共11页

L-苏氨酸醛缩酶(LTA)是一种重要的生物催化剂,能够催化醛和甘氨酸生成β羟基α氨基酸。因为β羟基α氨基酸具有两个手性中心,是重要的手性砌块,广泛应用于医药、食品和农业等领域。利用LTA催化手性C—C键合成反应原子经济性高,符合绿色... L-苏氨酸醛缩酶(LTA)是一种重要的生物催化剂,能够催化醛和甘氨酸生成β羟基α氨基酸。因为β羟基α氨基酸具有两个手性中心,是重要的手性砌块,广泛应用于医药、食品和农业等领域。利用LTA催化手性C—C键合成反应原子经济性高,符合绿色可持续发展理念,是目前的研究热点之一。但是,野生LTA存在非对映体选择性不高、酶活低及稳定性差等缺点,限制了其在手性合成中的应用。近年来,利用LTA合成高价值手性化学品的理论研究和工业应用取得了重大突破。基于此,本文综述了LTA新酶挖掘、机制解析、分子改造和手性砌块合成等方面的最新研究进展,为LTA的深入研究和工业应用提供思路和借鉴。 展开更多

关键词 L-苏氨酸醛缩酶 非对映体选择性 理性设计 定向进化 手性砌块

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L-苏氨酸醛缩酶催化合成L-4-硝基苯基丝氨酸 被引量：4

7

作者 余进海 吴婷 +2 位作者 刘均忠 张宏娟 焦庆才 《精细化工》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第12期2039-2044,2064,共7页

利用pGEX-KG载体在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达L-苏氨酸醛缩酶,以对硝基苯甲醛、甘氨酸为底物,采用酶法合成了L-4-硝基苯基丝氨酸,优化了反应条件,得到的最佳条件为:反应温度45℃,pH=8.0,甘氨酸浓度500mmol/L,对硝基苯甲醛浓度100mmol... 利用pGEX-KG载体在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达L-苏氨酸醛缩酶,以对硝基苯甲醛、甘氨酸为底物,采用酶法合成了L-4-硝基苯基丝氨酸,优化了反应条件,得到的最佳条件为:反应温度45℃,pH=8.0,甘氨酸浓度500mmol/L,对硝基苯甲醛浓度100mmol/L,每升转化液含1.6g全细胞,反应24h后,L-4-硝基苯基丝氨酸质量浓度达到9.72g/L,对硝基苯甲醛转化率为43%。放大至500mL后转化液经过活性炭分离纯化得到产物3.92g,总收率为35%。 展开更多

关键词 L-苏氨酸醛缩酶 对硝基苯甲醛 L-4-硝基苯基丝氨酸 活性炭吸附柱 生物工程

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低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因工程菌的构建 被引量：1

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作者 韦平和 吴滔 +1 位作者 吴梧桐 余霁 《药物生物技术》 CAS CSCD 2000年第2期86-89,共4页

应用PCR技术从E coliJM 10 5中扩增出长约 1kb的低特异性L 苏氨酸醛缩酶基因 ,将其插入高表达载体 pET 11c的NdeI/BamHI位点 ,转化E coliBL 2 1(DE3) ,构建高产低特异性L 苏氨酸醛缩酶基因工程菌。SDS PAGE和薄层扫描表明 ,经IPTG诱导 2... 应用PCR技术从E coliJM 10 5中扩增出长约 1kb的低特异性L 苏氨酸醛缩酶基因 ,将其插入高表达载体 pET 11c的NdeI/BamHI位点 ,转化E coliBL 2 1(DE3) ,构建高产低特异性L 苏氨酸醛缩酶基因工程菌。SDS PAGE和薄层扫描表明 ,经IPTG诱导 2h ,工程菌低特异性L 苏氨酸醛缩酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的 72 9%。酶活测定结果表明 ,39株工程菌低特异性L 苏氨酸醛缩酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高 ,其中 86号是宿主菌的 31倍。 展开更多

关键词 低特异性L-苏氨酸醛缩酶 基因工程菌 合成

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Pseudomonas putida KT2440低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达、酶学性质及温度稳定性提高 被引量：1

9

作者 李利宏 张荣珍 +4 位作者 周丽仙 柳志永 旋凯昂 饶俊超 徐岩 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期2013-2023,共11页

【目的】从Pseudomonas putida KT2440基因组中,钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(lta E),构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质,和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。【方法】以P. putida KT2440基因组DNA为模板,PCR扩增... 【目的】从Pseudomonas putida KT2440基因组中,钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(lta E),构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质,和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。【方法】以P. putida KT2440基因组DNA为模板,PCR扩增出lta E基因,构建重组表达质粒p ET28a-KT2440并转化Escherichia coli BL21 (DE3),获得重组菌E. coli BL21 (DE3)/p ET-KT2440,利用Ni2+柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶(LTA),对关键氨基酸位点Thr206和Lys207实施定点突变。【结果】SDS-PAGE结果表明LTA在大肠杆菌中获得高效表达,分子量为40k Da左右,与理论值大小相符。Ni2+柱亲和层析纯化LTA,获得单一条带。利用双酶耦联法测得LTA酶活为5577.3U/mg,最适反应温度为50°C,最适p H为8.0。在温度低于45°C,p H 5.0-9.0时,重组酶较稳定。LTA酶的Km和kcat值为23.95 mmol/L和19216.6 s–1。Mg2+、Ca2+金属离子对LTA有明显的促进作用,而Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等对酶有明显的抑制作用。该酶在叔丁基甲基醚溶剂中具有良好的耐受性,在叔丁基甲基醚中保存1h后仍保留90%以上的酶活。Thr206Ser突变明显提高了酶对温度的稳定性。Lys207对酶催化功能是必需的,该位点突变对酶活都是致死的。【结论】克隆并表达P. putida KT2440的LTA酶,研究了酶学性质,通过定点改造提高了酶的温度稳定性,筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂,为LTA酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础。 展开更多

关键词 恶臭假单胞菌 低特异性L-苏氨酸醛缩酶 酶学性质 致死突变 温度稳定性

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氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶及其应用

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作者 陈开通 郑文隆 +2 位作者 杨立荣 徐刚 吴坚平 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期55-63,共9页

L-苏氨酸醛缩酶(L-Threonine aldolase,L-TA)可以催化甘氨酸和醛合成β-羟基-α-氨基酸。β-羟基-α-氨基酸具有两个手性中心,是多种手性药物的中间体。但是,游离的L-TA难以重复利用,分离纯化困难,严重阻碍了工业化应用。固定化技术可... L-苏氨酸醛缩酶(L-Threonine aldolase,L-TA)可以催化甘氨酸和醛合成β-羟基-α-氨基酸。β-羟基-α-氨基酸具有两个手性中心,是多种手性药物的中间体。但是,游离的L-TA难以重复利用,分离纯化困难,严重阻碍了工业化应用。固定化技术可以有效解决这些问题。利用氨基树脂NAA固定化来源于Bacillus nealsonii的L-苏氨酸醛缩酶,采用戊二醛作为交联剂,经过条件优化确定最佳固定化条件为:加酶量13 U、载体量0.6 g、0.4%(V/V)戊二醛、活化时间2 h、p H 8.5、35℃、固定化5 h。在此条件下,固定化酶酶活回收率为85.7%。在30℃下半衰期可达59天,为游离酶的6.5倍。将其应用于合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸,使用460 h后,残余酶活为79.4%。进一步开发了载体再利用策略,将失活固定化酶表面的氨基用戊二醛活化后,再与新的游离酶进行固定化,实现载体的再利用。利用该方法载体可重复利用两次,制备的固定化酶仍能使用460h。该方法大大降低了固定化成本,为固定化L-TA的工业化应用打下坚实的基础。 展开更多

关键词 L-苏氨酸醛缩酶 固定化 载体再利用 氨基树脂L-syn-对甲砜基苯丝氨酸

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两种新型L-苏氨酸醛缩酶的鉴定及活性检测方法

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作者 任思羽 程新宽 +2 位作者 张宇辉 庄建文 马龙 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期233-240,共8页

为了实现重要医药中间体β-羟基-α-氨基酸的生物酶法合成,挖掘验证新型的L-苏氨酸醛缩酶。以pET-28a(+)作为表达载体,通过蛋白表达纯化、薄层层析色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)技术分析L-苏氨酸醛缩酶及其催化产物的性质。基于4-氨基... 为了实现重要医药中间体β-羟基-α-氨基酸的生物酶法合成,挖掘验证新型的L-苏氨酸醛缩酶。以pET-28a(+)作为表达载体,通过蛋白表达纯化、薄层层析色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)技术分析L-苏氨酸醛缩酶及其催化产物的性质。基于4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑(Purpald)显色试剂开发检测醛缩酶的新方法。Streptomyces coelicolor SCO1844(天蓝色链霉菌,S.coelicolor SCO1844)和Streptomyces xinghaiensis SFR7A(星海链霉菌,S.xinghaiensis SFR7A)来源的醛缩酶被证明能够成功地合成β-羟基-α-氨基酸,且均为L-苏氨酸醛缩酶,实现了以苯甲醛和甘氨酸为底物合成l-threo/erythron-苯基丝氨酸的醇醛缩合反应。开发的可视化活性检测方法可以实现醛缩酶的快速鉴定和高通量筛选。两种新型L-苏氨酸醛缩酶的鉴定以及活性检测方法的开发,不仅丰富了生物法合成β-羟基-α-氨基酸的酶库,也为下一步对L-苏氨酸醛缩酶进行分子改造提高其催化活性和选择性奠定了研究基础。 展开更多

关键词 L-苏氨酸醛缩酶 β-羟基-α-氨基酸 生物合成 活性检测 链霉菌

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捻转血矛线虫苏氨酸醛缩酶结构域包含蛋白的克隆与表达及其体外对山羊外周血单个核细胞功能的影响

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作者 温玉玲 王玉俭 +4 位作者 吴玲燕 严若峰 徐立新 宋小凯 李祥瑞 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期502-508,共7页

目的]本文旨在探讨捻转血矛线虫苏氨酸醛缩酶结构域包含蛋白(TA-1)体外对山羊外周血单个核细胞(PBMC)功能的影响。[方法]根据TA-1基因序列设计引物进行PCR,将所得目的片段克隆到pMD19-T载体进行测序和分析;将该片段亚克隆到pET-32a(+)... 目的]本文旨在探讨捻转血矛线虫苏氨酸醛缩酶结构域包含蛋白(TA-1)体外对山羊外周血单个核细胞(PBMC)功能的影响。[方法]根据TA-1基因序列设计引物进行PCR,将所得目的片段克隆到pMD19-T载体进行测序和分析;将该片段亚克隆到pET-32a(+)载体中构建表达质粒pE T-32a/TA-1。重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE观察其表达情况,对重组蛋白(rT A-1)纯化、连续浓度梯度递减的尿素溶液透析复性。从健康山羊采集的血液分离获得的PBMC与rT A-1(10μg·mL^(-1))共孵育,以rT A-1免疫SD大鼠制备的血清作为一抗,用免疫荧光抗体技术观察rTA-1与山羊PBMC的结合情况;分别用0、10、20和40μg·mL^(-1)的rT A-1刺激PBMC,采用CCK-8法测定细胞增殖情况,采用迁移小室研究细胞迁移情况,用qP CR技术测定各试验组PBMC中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ及TGF-βmRNA转录情况,采用硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)分泌,采用流式细胞仪检测单核细胞吞噬FITC-dextran的能力。[结果]从捻转血矛线虫总RNA中扩增出约1 194 bp的DNA片段,该基因序列与GenB ank中捻转血矛线虫TA-1基因序列的相似性为95%。SDS-PAGE结果显示该基因成功在大肠杆菌中表达,主要以包涵体形式存在,融合蛋白相对分子质量为64×103,并能与山羊PBMC结合。细胞刺激结果显示rT A-1促进PBMC的增殖(P<0.05)和迁移(P<0.05),刺激细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ和IL-17的表达(P<0.01),增强NO的分泌(P<0.05)。这些影响尤其在rTA-1浓度为20μg·mL^(-1)时极显著(P<0.01),并在40μg·mL^(-1)时极极显著增强单核细胞的吞噬功能(P<0.001)。[结论]rTA-1可作为捻转血矛线虫的一个候选抗原,主要诱导Th2类免疫反应。 展开更多

关键词 捻转血矛线虫 苏氨酸醛缩酶结构域包含蛋白 山羊 外周血单个核细胞

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