一种基于Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72的免疫学检测方法 被引量：13

1

作者 孔善云 姜有声 +2 位作者 许丹 谢骏 吕利群 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期328-335,共8页

Ⅱ型鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)是引起养殖异育银鲫(Carassius auratus gibelio)造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技术已经建立,但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报... Ⅱ型鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)是引起养殖异育银鲫(Carassius auratus gibelio)造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技术已经建立,但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。本研究目的是利用Cy HV-2编码的ORF72基因(Gen Bank登录号:AFJ20502.1)所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原,通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体,从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用PCR方法从纯化的Cy HV-2基因组中扩增ORF72基因,并把该基因克隆至原核表达载体PGEX-4T-3,并转化到大肠杆菌中诱导表达,诱导表达的产物通过SDS-PAGE进行鉴定,对表达的重组蛋白进行纯化。用已纯化的72重组蛋白对小鼠进行免疫,制得72重组蛋白的抗体。Western blot检测表明所制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也可以识别Cy HV-2病毒粒子上的衣壳蛋白72。在上述基础上建立了基于Western blot技术的Cy HV-2抗体检测技术:用纯化的72重组蛋白作为检测抗原,鲫鱼血清用作一抗,兔抗鲫Ig M多克隆抗体作为二抗,酶标羊抗兔作为三抗鉴定鲫鱼是否存在Cy HV-2特异性抗体。在对急性感染期的临床样本检测中,本方法能在所有样本中检测出ORF72特异性抗体存在,表明72重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于确诊鲫鱼是否感染Cy HV-2。本研究建立的实验室免疫学检测方法为商品化免疫学检测技术的开发奠定了基础,对Cy HV-2的检验检疫具有一定的临床应用价值。 展开更多

关键词 Ⅱ型鲤疱疹病毒 ORF72 原核表达 多克隆抗体 临床检测 异育银鲫

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饲料酵母培养物提高异育银鲫的抗氧化、免疫能力及CyHV-2病毒攻毒保护能力 被引量：9

2

作者 孙飞 吕昊 +6 位作者 郁浓 叶元土 蔡春芳 吴萍 石瑶瑶 周文豪 李永娟 《中国粮油学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第1期97-106,共10页

为了研究饲料中酵母培养物(Yeast culture,YC)代替等质量鱼粉对异育银鲫生长性能和生理健康的影响。在含豆油(正对照)、氧化豆油(负对照)的基础饲料中分别以0%、1%、2%、3%的YC替代等质量的鱼粉,分别记为S、SC1、SC2、SC3、O、OC1、OC2... 为了研究饲料中酵母培养物(Yeast culture,YC)代替等质量鱼粉对异育银鲫生长性能和生理健康的影响。在含豆油(正对照)、氧化豆油(负对照)的基础饲料中分别以0%、1%、2%、3%的YC替代等质量的鱼粉,分别记为S、SC1、SC2、SC3、O、OC1、OC2、OC3,在池塘中养殖异育银鲫[初始体重为(7.08±0.01) g] 65 d。养殖实验结束后,用异育银鲫CyHV-2病鱼内脏组织液对各实验组鲫鱼进行攻毒实验。结果显示:SC1、SC2、SC3组与S组比较,SGR和FCR无显著差异(P>0.05)。O组与S组比较,SGR下降6.53%(P<0.05);FCR提高16.27%(P<0.05)。O组结果比较:OC1、OC2、OC3组SGR均提高(P<0.05),FCR均下降(P<0.05)。各组血细胞和血清指标发生一定程度的变化。攻毒实验结果显示,与S组比较,SC1、SC2、SC3组累积死亡数降低;与O组比较,OC1、OC2、OC3组累积死亡数也降低。本实验结果表明,1)在基础日粮鱼粉为12%的条件下,用1%~3%YC替代等质量的鱼粉具有一定的可行性。2)氧化豆油会导致异育银鲫氧化损伤。3)在含有氧化豆油的日粮中,饲料YC可以一定程度修复氧化损伤。4)本实验条件下,饲料YC可以增强异育银鲫免疫防御能力、抗氧化损伤的能力,综合表现为对CyHV-2病毒攻毒保护具有较好的效果。 展开更多

关键词 异育银鲫 酵母培养物 生长速度 饲料效率 氧化损伤 氧化油脂 cyhv-2

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江苏盐城地区异育银鲫大红鳃疾病病原学研究及病理学观察 被引量：7

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作者 刘韬 汪开毓 +5 位作者 陈俊杰 刘天强 李茂 康岳华 段靖 贺扬 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期928-934,共7页

为鉴定近期江苏盐城地区养殖异育银鲫"大红鳃"疾病病原,研究从患病濒死鱼中分离到两株致病菌并对其理化特性、分子生物学、感染病理学进行了研究,同时开展了鉴别诊断和回归试验以及药敏检测。结果显示,两分离株理化特性与温... 为鉴定近期江苏盐城地区养殖异育银鲫"大红鳃"疾病病原,研究从患病濒死鱼中分离到两株致病菌并对其理化特性、分子生物学、感染病理学进行了研究,同时开展了鉴别诊断和回归试验以及药敏检测。结果显示,两分离株理化特性与温和气单胞菌(A.sobria)特征相符,与Gen Bank中A.sobria的gyr B基因同源性达99%以上,在系统发育树上均与A.sobria聚为一族。同时与鲤科疱疹病毒2型(Cy HV-2)鉴别诊断结果表明,患病鱼组织中Cy HV-2检测为阴性。组织学上,鳃和肾组织具有典型病理变化。人工感染两株A.sobria后,鱼体出现与自然发病相似的"大红鳃"症状,并能从发病鱼组织中再分离到相同病原菌;而人工感染Cy HV-2组织匀浆后的鲫虽然出现死亡,但无"大红鳃"症状出现。综上,确认此次"大红鳃"疾病的病原为A.sobria。药敏实验表明,分离菌株对诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素三种药物敏感。研究为临床上更好的预防异育银鲫"大红鳃"疾病奠定了基础。 展开更多

关键词 异育银鲫 温和气单胞菌 大红鳃 cyhv-2 病理组织学

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鲤科疱疹病毒2型Taqman实时荧光PCR方法的建立 被引量：7

4

作者 于力 王津津 +4 位作者 史秀杰 郑晓聪 贾鹏 兰文升 刘荭 《中国动物检疫》 CAS 2015年第10期80-84,共5页

本研究针对鲤科疱疹病毒2型(CyHV-2)的主要衣壳蛋白基因,设计了特异性引物和Taqman探针,建立了实时荧光PCR方法。其检测下限为83拷贝,标准曲线R2>0.998,且经比对,灵敏度与现行方法相当。选取了健康异育银鲫、金鱼、鲤鱼以及常见4种水... 本研究针对鲤科疱疹病毒2型(CyHV-2)的主要衣壳蛋白基因,设计了特异性引物和Taqman探针,建立了实时荧光PCR方法。其检测下限为83拷贝,标准曲线R2>0.998,且经比对,灵敏度与现行方法相当。选取了健康异育银鲫、金鱼、鲤鱼以及常见4种水生DNA病毒以及7种水生环境细菌进行特异性实验,结果均无交叉反应。重复性实验显示,2份独立的15次重复结果变异系数均小于2%,说明本方法重复性好。本方法能作为目前CyHV-2疫病检测方法的有效补充,对该病的防控具有重要的意义。 展开更多

关键词 cyhv-2 实时荧光PCR TAQMAN 异育银鲫 金鱼

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基于不同PCR方法的Ⅱ型鲤疱疹病毒检测技术研究 被引量：7

5

作者 谢亚君 税典章 +3 位作者 吴萍 叶元土 王敏 蒋蓉 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期1018-1025,共8页

异育银鲫"鳃出血病"是一种因感染了鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)而引起的疾病,近年来给江苏异育银鲫养殖业造成了巨大的经济损失。为了能够建立及时、有效检出Ⅱ型鲤疱疹病毒的技术,本研究在克隆了Cy HV-2解旋酶基因和三联体蛋白... 异育银鲫"鳃出血病"是一种因感染了鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)而引起的疾病,近年来给江苏异育银鲫养殖业造成了巨大的经济损失。为了能够建立及时、有效检出Ⅱ型鲤疱疹病毒的技术,本研究在克隆了Cy HV-2解旋酶基因和三联体蛋白基因的基础上,建立了检测CyHV-2的普通PCR、双重PCR、巢式PCR、环介导等温扩增、实时荧光定量PCR等方法,并对这5种PCR技术检测Cy HV-2的灵敏性进行了系统研究。结果表明,针对CyHV-2病毒的解旋酶基因和三联体蛋白基因,普通PCR能够检测出的极限值是2.4×10~4 copies/μL,双重PCR是1.4×10~4 copies/μL,巢式PCR是2.4×10^(-2)copies/μL,荧光定量PCR是2.4×10^(-2)copies/μL,环介导等温扩增是3.5×10~2 copies/μL。通过采用以上方法对从不同地区采集的54尾异育银鲫提取的DNA为模板进行临床检验,测定不同检测方法的阳性检出率。结果表明,实时荧光定量PCR和巢式PCR的检出率很高,分别为89%和90.7%;普通PCR的检出率最低,为68.5%。综合检测灵敏度和阳性检出率,环介导等温扩增(LAMP)是一种适用于生产实践的能有效检测CyHV-2的良好技术。 展开更多

关键词 Ⅱ型鲤疱疹病毒 双重PCR 巢式PCR 环介导等温扩增 荧光定量PCR

原文传递

转录因子NF-κB对鲤疱疹病毒Ⅱ型基因启动子的表达调控研究

6

作者 谢雅晴 龙晨 吕利群 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期88-93,共6页

为深入探究NF-κB信号通路对CyHV-2感染过程的影响,在CyHV-2感染的GiCF细胞中加入NF-κB激动剂,通过RT-qPCR和Western Blot分析在感染24、72、96 h后CyHV-2编码基因在转录和翻译水平的表达情况。结果显示,在加入NF-κB激动剂后的72、96 ... 为深入探究NF-κB信号通路对CyHV-2感染过程的影响,在CyHV-2感染的GiCF细胞中加入NF-κB激动剂,通过RT-qPCR和Western Blot分析在感染24、72、96 h后CyHV-2编码基因在转录和翻译水平的表达情况。结果显示,在加入NF-κB激动剂后的72、96 h,CyHV-2编码基因转录和翻译水平均明显高于对照组,提示NF-κB促进CyHV-2编码基因的转录及翻译。为进一步阐明NF-κB如何影响CyHV-2的转录和翻译,利用生物信息学软件预测CyHV-2部分编码基因的启动子序列中和NF-κB的结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验分析NF-κB对启动子活性的影响。结果表明,NF-κB过表达提高了病毒基因启动子活性,提示NF-κB可以通过促进CyHV-2基因的启动子活性来增强病毒复制水平。研究结果有助深入探究CyHV-2基因的表达翻译机制,也为开发基于NF-κB信号通路靶点的新的抗病毒抑制剂提供理论支撑。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒Ⅱ型 NF-ΚB 启动子 转录调控 双荧光素酶报告基因

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鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66截短蛋白多克隆抗体的制备及互作多肽筛选 被引量：2

7

作者 张小米 阙顺政 +2 位作者 龙晨 王浩 吕利群 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期796-802,共7页

为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经... 为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠,制备鼠抗tORF66多克隆抗体。将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白。经Western Blot检测显示,抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型,效价较高,特异性较好。噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示,得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′。该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性,推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用。这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒Ⅱ型 ORF66截短蛋白 原核表达 多克隆抗体 噬菌体展示

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异育银鲫(Carassius auratus gibelio)脊髓组织细胞系的建立及对CyHV-2的敏感性 被引量：6

8

作者 魏钰娟 潘晓艺 +7 位作者 蔺凌云 姚嘉赟 郝贵杰 曹铮 夏焱春 尹文林 刘忆瀚 沈锦玉 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期1232-1238,共7页

鲫造血器官坏死病是近些年来危害养殖鲫鱼最为严重的传染性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)。本研究以异育银鲫(Carassius auratus gibelio)脊髓组织为材料,进行组织细胞体外培养,构建对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏... 鲫造血器官坏死病是近些年来危害养殖鲫鱼最为严重的传染性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)。本研究以异育银鲫(Carassius auratus gibelio)脊髓组织为材料,进行组织细胞体外培养,构建对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脊髓细胞系(Spinalcordtissuecell lines of Carassius auratus gibelio, CSC)。采用组织块移植法,进行异育银鲫脊髓细胞的原代培养,并进行传代,已传代至第128代次,获得稳定传代的细胞系后,采用低渗法进行细胞染色体核型分析,并进行鲤疱疹病毒Ⅱ型的敏感性测试与传代。结果表明,以含10%胎牛血清的L-15培养基,在24℃恒温条件下,可稳定传代培养异育银鲫脊髓细胞,传代细胞呈成纤维样或纺锤状;核型分析显示,染色体数为156±2条,该细胞为三倍体细胞。通过对CyHV-2敏感性的测试,CSC细胞感染CyHV-2后产生典型的细胞病变,感染第7天的病变细胞液的TCID50达到109.33/mL,CyHV-2病毒可在CSC细胞上稳定传代;通过对病变细胞的电镜观察,可见大量直径为128-134nm大小的疱疹样病毒颗粒。以上研究结果表明,本研究构建的异育银鲫脊髓细胞系对CyHV-2敏感,并在细胞上能进行稳定传代,传代病毒具有较高病毒滴度,这为鲤疱疹病毒Ⅱ型的深入研究及疫苗开发奠定了重要的基础。 展开更多

关键词 异育银鲫(Carassius auratus gibelio) 脊髓组织细胞系 鲤疱疹病毒Ⅱ型

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鲤科疱疹病毒Ⅱ型射阳株的分离与鉴定 被引量：5

9

作者 李茂 肖丹 +4 位作者 刘天强 刘衍鹏 黄冠军 汪开毓 罗远会 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2015年第3期93-96,共4页

对患＂鳃出血＂病的异育银鲫（Carassius auratus gibelio）病灶组织进行分离,并通过回归感染试验、细胞分离鉴定、电镜观察以及PCR几种方法结合来鉴定。结果显示：健康异育银鲫注射组织滤液5 d后开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡... 对患＂鳃出血＂病的异育银鲫（Carassius auratus gibelio）病灶组织进行分离,并通过回归感染试验、细胞分离鉴定、电镜观察以及PCR几种方法结合来鉴定。结果显示：健康异育银鲫注射组织滤液5 d后开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为80%,对照组没有死亡。对患病鱼内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察发现组织内有大量的病毒颗粒,成熟的病毒粒子直径大小170~200 nm,与疱疹病毒Ⅱ型病毒粒子相符。滤液经疱疹病毒Ⅱ型特异性的PCR检测,获得阳性目的片段,同时将无菌处理的病样滤液接种胖头鲤细胞（FHM）,培养1 d后出现明显的细胞病变（CPE）,单层细胞网状收缩,坏死细胞聚集。收集细胞培养液,进行病毒特异性的PCR检测,并检测到436 bp的阳性片段。结果表明：从江苏射阳某＂鳃出血＂病异育银鲫养殖鱼塘分离到的病毒为疱疹病毒Ⅱ型（Cy HV-2）病毒。 展开更多

关键词 鲤科疱疹病毒Ⅱ型 异育银鲫(Carassius auratus gibelio) 分离 鉴定

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鲫CyHV-2病毒病的诊断及组织病理损伤研究 被引量：2

10

作者 熊关庆 段靖 +8 位作者 冯杨 倪萍 黄小丽 汪开毓 邓永强 耿毅 陈德芳 欧阳萍 杨世勇 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2019年第3期397-403,共7页

【目的】为了确定一例鲫(Carassius auratus)鳃出血症的病原。【方法】无菌操作条件下从患病鱼的肝脏、脾脏等病原灶处分离病原菌;利用压片法取鳃丝、体表粘液进行观察,检查是否有寄生虫感染;取鳃、肝脏、脾脏、肾脏用聚合酶链式反应(P... 【目的】为了确定一例鲫(Carassius auratus)鳃出血症的病原。【方法】无菌操作条件下从患病鱼的肝脏、脾脏等病原灶处分离病原菌;利用压片法取鳃丝、体表粘液进行观察,检查是否有寄生虫感染;取鳃、肝脏、脾脏、肾脏用聚合酶链式反应(PCR)技术检测鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),并构建系统发育树,结合组织病理学技术以分析鳃出血症的病因。【结果】结果发现,病鱼尾鳍末端发白,鳃丝出血、末端轻微溃烂,有少量红色腹水;寄生虫学检测未发现鳃丝和体表黏液有寄生虫寄生;通过微生物学诊断,未见病原菌生长;PCR检测结果显示患病鲫体内CyHV-2呈阳性;组织病理学检测表明,患病鲫的主要损伤靶器官为脾脏、鳃、肾脏、肠道、心脏和肝脏,主要引起重度鳃出血和坏死性鳃炎,重度坏死性脾炎、中度至重度肠炎、中度至重度坏死性肾炎、中度坏死性心肌炎和中度心内膜炎和轻度坏死性肝炎。【结论】推断本次鲫鳃出血症为CyHV-2感染导致。 展开更多

关键词 鲫 鲤疱疹病毒Ⅱ型 cyhv-2 组织病理学

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鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)灭活疫苗制备及其免疫效力测定 被引量：2

11

作者 潘晓艺 蔺凌云 +5 位作者 朱悦 姚嘉赟 尹文林 刘忆瀚 陈凡 沈锦玉 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1143-1150,共8页

鲫造血器官坏死病是由鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)引起的危害我国养殖鲫鱼(Carassius auratus)最严重的病毒性疾病。为制备有效预防鲫造血器官坏死病的灭活疫苗,以CyHV-2代表流行株CNDF-TB2015为疫苗株,以CSC细胞系进行病毒增殖,并采用不同... 鲫造血器官坏死病是由鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)引起的危害我国养殖鲫鱼(Carassius auratus)最严重的病毒性疾病。为制备有效预防鲫造血器官坏死病的灭活疫苗,以CyHV-2代表流行株CNDF-TB2015为疫苗株,以CSC细胞系进行病毒增殖,并采用不同浓度的病毒对不同规格鲫鱼进行攻毒,建立攻毒模型。结果表明,培养的病毒滴度达10^(10)TCID_(50)/mL,以4×10^(7)TCID_(50)/尾的剂量腹腔注射感染体重300 g的鲫鱼可造成100%的死亡率。对病毒灭活剂甲醛、β-丙内酯和BEI灭活条件进行筛选优化,对疫苗免疫佐剂763A、IMS1312、铝胶和M402进行筛选,结果表明,浓度为10^(8.3) TCID_(50)/mL的病毒液最佳灭活条件为终浓度10 mmol/L的BEI 37℃灭活72 h,疫苗制备最佳佐剂为水佐剂IMS1312。对灭活疫苗的最小免疫剂量、最佳免疫剂量和有效免疫产生期进行测定,结果表明,要获得70%以上保护率的最小免疫剂量为8×10^(6)TCID_(50)/尾,最佳免疫剂量为4×10^(7)TCID_(50)/尾,在免疫4周后保护率可达80%,5周后保护率达到100%。制备的灭活疫苗为鲫造血器官坏死病的免疫预防提供了有力手段,也为其他水产动物病毒灭活疫苗的制备提供了借鉴。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型 鲫造血器官坏死病 灭活疫苗 免疫效力

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注射热休克蛋白促进剂或抑制剂后异育银鲫感染CyHV-2时生理状态的响应 被引量：3

12

作者 董华雨 陈胜峰 +3 位作者 吴萍 税典章 许凡 高璐 《江西水产科技》 2019年第3期8-12,共5页

鉴于异育银鲫鳃出血病与温度相关的发病特征,分别对异育银鲫注射HSP70抑制剂和促进剂进行了其体内热休克蛋白的人工干预。研究发现,养殖池塘自然发病的具有鳃出血病典型症状的异育银鲫,其肝脏内HSP70基因的表达量与健康异育银鲫相比明... 鉴于异育银鲫鳃出血病与温度相关的发病特征,分别对异育银鲫注射HSP70抑制剂和促进剂进行了其体内热休克蛋白的人工干预。研究发现,养殖池塘自然发病的具有鳃出血病典型症状的异育银鲫,其肝脏内HSP70基因的表达量与健康异育银鲫相比明显升高,人工感染CyHV-2病毒后,肝脏内HSP70表达量在24h后显著增加,当鱼体表现出发病症状时,HSP70表达量极显著上升。对照组在人工感染CyHV-2后,血清中天门冬氨酸氨基转移酶在鱼体发病时显著升高,且在发病时与注射促进剂和抑制剂组都有极显著差异;注射HSP70促进剂组在人工感染CyHV-2后,血清中天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶在12h时显著升高。注射HSP70抑制剂的异育银鲫体内病毒数在感染病毒后12h时,就达到最高点,明显高于对照组及注射促进剂组的同时间段病毒数。说明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的积极作用。 展开更多

关键词 异育银鲫 热休克蛋白 cyhv-2 谷氨酰胺 槲皮素

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鲤疱疹病毒Ⅱ型对异育银鲫背鳍细胞的显微形态与免疫基因表达水平的影响 被引量：3

13

作者 夏思瑶 王浩 +4 位作者 Patorida Podok 许丹 姜有声 吕利群 佐野元彦 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1915-1922,共8页

为研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)体外感染复制特征以及异育银鲫抗病毒免疫应答反应。本实验采用组织块培养法建立了异育银鲫背鳍细胞的原代培养体系。结果显示,在10 d左右可观察到组织块迁移分离出新的单层细胞,3周左右细胞可覆盖底部面... 为研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)体外感染复制特征以及异育银鲫抗病毒免疫应答反应。本实验采用组织块培养法建立了异育银鲫背鳍细胞的原代培养体系。结果显示,在10 d左右可观察到组织块迁移分离出新的单层细胞,3周左右细胞可覆盖底部面积为25cm2培养瓶的底部;经Cy HV-2悬液感染离体培养的原代细胞,3 d后病毒滴度增殖至106拷贝/m L;在病毒感染6 d后出现典型的细胞病变效应;Cy HV-2感染原代细胞后,分析前期通过鱼体水平实验鉴定出的与该病毒感染相关的免疫基因:PNP5a、MPO、MHCⅠ、LYZ-C、IL-11、ITLN、PNP5a和DUSP,Real-time Rt-PCR结果显示大部分基因在细胞水平均有显著性的上调,与鱼体水平实验结果一致。本研究建立了原代培养的异育银鲫背鳍细胞,用于构建体外感染Cy HV-2病毒的细胞模型,为深入研究Cy HV-2的感染复制规律及其与宿主的相互作用关系,以及细胞水平筛选抗病毒药物实验奠定了基础。 展开更多

关键词 异育银鲫 鲤疱疹病毒Ⅱ型 背鳍细胞 原代培养 Real time Rt-PCR

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池塘环境中异育银鲫鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)的检测与传播途径分析 被引量：2

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作者 高敏敏 税典章 +5 位作者 吴萍 叶元土 吴韬 何冬成 陈卓 崔振华 《江苏农业科学》 2018年第24期187-190,共4页

以发生鲫鱼鳃出血病的4个池塘为对象,以鱼体肝、胰、脾、肾脏的混合物、鲫鱼体表黏液、鲫鱼鱼卵和水体浮游生物为试验材料,采用PCR扩增后电泳检测239 bp的鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)特异条带的方法,证实这4个池塘发生了CyHV-2病,鲫鱼肝、... 以发生鲫鱼鳃出血病的4个池塘为对象,以鱼体肝、胰、脾、肾脏的混合物、鲫鱼体表黏液、鲫鱼鱼卵和水体浮游生物为试验材料,采用PCR扩增后电泳检测239 bp的鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)特异条带的方法,证实这4个池塘发生了CyHV-2病,鲫鱼肝、胰、脾、肾脏中含有CyHV-2;鲫鱼体表黏液中检测到CyHV-2,在部分雌性鲫鱼个体的卵巢中也检测到了CyHV-2,提示通过鱼体体表黏液在鱼体之间、通过鱼卵向鱼苗传播CyHV-2的可能性。在鲢鱼内脏中检测到CyHV-2,而其他种类如草鱼、鳙鱼、野杂鱼,以及浮游生物中没有检测到CyHV-2,提示通过池塘中其他种类传播CyHV-2的可能性,但主要传播途径还是依赖鲫鱼的体表黏液进行横向传播,通过鱼卵进行纵向传播的可能性。 展开更多

关键词 cyhv-2 体表黏液 鱼卵 传播途径 异育银鲫

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江苏地区鲫鱼造血器官坏死病风险分析 被引量：1

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作者 袁锐 刘训猛 +4 位作者 陈静 吴亚锋 王晶晶 倪金俤 方苹 《安徽农业科学》 CAS 2019年第8期104-108,共5页

[目的]了解江苏省鲫鱼造血器官坏死病的流行情况。[方法]应用PCR方法对2015—2017年的养殖鲫鱼成鱼和苗种进行病原鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)检测,并进行风险评估。[结果]共检测样品265例,检出阳性样品32例,阳性率为12.83%,其中阳性率最高... [目的]了解江苏省鲫鱼造血器官坏死病的流行情况。[方法]应用PCR方法对2015—2017年的养殖鲫鱼成鱼和苗种进行病原鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)检测,并进行风险评估。[结果]共检测样品265例,检出阳性样品32例,阳性率为12.83%,其中阳性率最高的年份阳性率高达25.00%。安徽省主要养殖鲫鱼区域均具有较高感染风险,无论成鱼还是苗种均可感染CyHV-2,而病原的遗传同源性高度统一,提示江苏地区CyHV-2未发生明显变异。[结论]该研究可为江苏地区鲫鱼造血器官坏死病风险分析提供基本数据,并为该病的防控措施提供参考。 展开更多

关键词 江苏省 鲫鱼造血器官坏死病 鲤疱疹病毒2型 遗传同源性 风险分析

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鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定 被引量：31

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作者 徐进 曾令兵 +4 位作者 杨德国 张辉 马杰 江南 范玉顶 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期1303-1309,共7页

采用细胞培养、超薄切片电镜观察、巢式PCR检测以及病毒DNA克隆与测序分析等技术。从湖北武汉一循环水养殖系统中患出血病异育银鲫（Carassius auratusgibelio）体内分离鉴定了一株鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2）病毒... 采用细胞培养、超薄切片电镜观察、巢式PCR检测以及病毒DNA克隆与测序分析等技术。从湖北武汉一循环水养殖系统中患出血病异育银鲫（Carassius auratusgibelio）体内分离鉴定了一株鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2）病毒，命名为鲤疱疹病毒2型武汉株（CyHV-2．WH）。患病鱼组织匀浆液接种锦鲤鳍条细胞系（Koi．Fin）可产生典型的细胞病变效应。用患病鱼组织匀浆液与细胞培养物分别人工感染异育银鲫，均可重复出与自然发病相同的症状，死亡率达100％。患病鱼脾与肾脏组织超薄切片电镜观察结果显示，病毒为具囊膜的球形病毒，囊膜直径为170-200am，病毒衣壳直径为110～120nm，病毒在细胞核内复制、组装。采用CyHV-2的特异引物对病鱼样本和感染细胞培养物样本进行巢式PCR检测，均能扩增出357bp的目的条带，将该扩增产物进行测序与比对分析后发现，其与GenBank中已报道的CyHV-2毒株的DNA解旋酶基因高度同源（99．44％以上）。与鲤疱疹病毒3型（CyHV-3）也有较高的同源性（81．55％）。系统进化分析结果显示，CyHV-2．WH株与JS2012、H．Fukuda、YCll0907等CyHV-2病毒株属同一分支。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型 异育银鲫 病毒分离 病毒鉴定 潜伏感染

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鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用 被引量：18

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作者 周勇 曾令兵 +2 位作者 张辉 范玉顶 徐进 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期607-613,共7页

针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组... 针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号。取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104copies/μL和3.02×102copies/μL。本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义。 展开更多

关键词 鲫 造血器官坏死症 鲤疱疹病毒Ⅱ型 TAQMAN REAL-TIME PCR 检测方法

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鲤疱疹病毒2型微滴式数字PCR快速检测方法的建立 被引量：16

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作者 郝中香 林华 +7 位作者 佘容 廖红 陈世界 杨苗 薛昌华 赵珊 韩国全 颜其贵 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期167-173,共7页

根据GenBank上登录的鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)ORF6基因序列(登录号:JQ815364.1)用Primer Express 3.0设计并合成ORF6基因特异性引物及Taq Man探针,建立了检测鲤疱疹病毒2型的微滴式数字PCR(dd PCR)方法。结果显示... 根据GenBank上登录的鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)ORF6基因序列(登录号:JQ815364.1)用Primer Express 3.0设计并合成ORF6基因特异性引物及Taq Man探针,建立了检测鲤疱疹病毒2型的微滴式数字PCR(dd PCR)方法。结果显示,dd PCR的检测灵敏度比qPCR高5倍。特异性和重复性检测结果表明,ddPCR和qPCR均具有良好的特异性和较高的重复性。qPCR和dd PCR标准曲线的r2值分别为0.999 2和0.997 5,表明ddPCR和qPCR均具有良好的线性关系。研究结果表明,该方法可以对CyHV-2进行可靠的检测,可以满足CyHV-2特性研究和感染诊断的需要。对60份临床样品的检测结果显示,在检出阳性的34份样品中,包含肾、脾、腮、肝、心和脑,表明该病毒在这些器官均有分布,其中肾的病毒含量相对最高,脑的病毒含量相对最低。总之,本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强、能快速检测到极低含量的病毒,适用于CyHV-2的快速检测和病原流行病学调查。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型 微滴式数字PCR 检测

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鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)感染对异育银鲫(Carassius auratus gibelio)组织器官的损伤作用 被引量：10

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作者 林秀秀 叶元土 +9 位作者 吴萍 腾峰 王敏 蒋蓉 段荣会 许凡 陈卓 高李松 刘进 蔡春芳 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期587-594,共8页

为分析感染Cy HV-2异育银鲫(Carassius auratus gibelio)体内不同器官组织结构和功能的损伤,采集健康和患病异育银鲫头肾、脾脏、体肾、肠道、肝胰脏、鳃各组织样本,通过石蜡切片,HE染色对各器官组织进行组织病理学观察并对肠道和鳃进... 为分析感染Cy HV-2异育银鲫(Carassius auratus gibelio)体内不同器官组织结构和功能的损伤,采集健康和患病异育银鲫头肾、脾脏、体肾、肠道、肝胰脏、鳃各组织样本,通过石蜡切片,HE染色对各器官组织进行组织病理学观察并对肠道和鳃进行扫描电镜观察。病鱼主要表现为,食欲减弱、离群独游、全身发黑、背鳍、尾鳍末端发白、眼球突出、肌肉充血,鳃呈鲜红色。在鳃丝末端由红色斑块,经解剖有红色腹水流出,组织器官广泛性损伤。组织病理学变化为,头肾和脾脏细胞溶解、免疫细胞侵润、免疫和造血系统严重破坏;体肾中肾小球萎缩、肾小管上皮细胞脱落、肾间质出现空泡、免疫细胞侵润;肠道绒毛增生、绒毛和微绒毛长度显著减少、粘膜下层显著增厚;肝胰脏中肝细胞出现溶解、中央静脉受损;鳃中毛细血管破坏、血管破裂或扩大、红细胞溢出、鳃小片基部细胞显著减少。结果表明,病毒对异育银鲫具有明显的致病性,可导致各器官组织发生病变,同时机体处于缺血、缺氧、营养不足、废物积累的内环境,这进一步加剧对异育银鲫主要的器官组织的损伤。 展开更多

关键词 异育银鲫(Carassius auratus gibelio) 鲤疱疹Ⅱ型病毒(cyhv-2) 出血病 扫描 组织病理学

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鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法 被引量：11

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作者 周勇 范玉顶 +4 位作者 徐进 马杰 江南 刘文枝 曾令兵 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2017年第1期61-65,共5页

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。... 根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒Ⅱ型 ORF4 原核表达 多克隆抗体 免疫荧光检测

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