肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

1

作者 王语涵 许雅萍 +6 位作者 李南 陈婷婷 李玲 高萍萍 王华 魏伟 孙妩弋 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期189-194,共6页

目的利用Cre-loxP基因敲除技术建立肝星状细胞特异性G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)基因敲除小鼠模型,为研究GRK2在肝星状细胞中的生物学功能提供动物模型基础。方法将loxP标记的Grk2基因小鼠(Grk2^(fl/... 目的利用Cre-loxP基因敲除技术建立肝星状细胞特异性G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)基因敲除小鼠模型,为研究GRK2在肝星状细胞中的生物学功能提供动物模型基础。方法将loxP标记的Grk2基因小鼠(Grk2^(fl/fl))和Lrat-Cre工具鼠进行多次繁殖,建立肝星状细胞特异性Grk2基因敲除(Grk2^(ΔHSC))小鼠模型。观察和分析小鼠的生长繁殖情况;通过PCR反应鉴定flox和Cre基因型;免疫荧光双染检测肝星状细胞中GRK2表达;Western blot检测小鼠肝星状细胞及肺、脾、肾脏、心脏组织中GRK2蛋白表达;HE染色观察肝脏及肺、脾、心脏、肾脏组织学形态。结果成功鉴定Grk2^(ΔHSC)小鼠基因型;两组小鼠体质量、繁殖能力无明显差异;免疫荧光双染及Western blot结果表明,Grk2^(ΔHSC)小鼠的肝星状细胞中GRK2蛋白水平明显低于对照组小鼠,Grk2^(ΔHSC)小鼠肺、脾、肾脏和心脏组织中GRK2蛋白表达与对照组相比无明显变化;HE染色结果显示,Grk2^(ΔHSC)小鼠肝脏及主要组织结构与Grk2^(fl/fl)相比差异无显著性,可用于后续研究。结论本研究应用Cre-loxP技术成功构建了肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠,为进一步研究GRK2在肝脏中的作用提供了优良工具。 展开更多

关键词 G蛋白偶联受体激酶2 cre-loxp重组酶系统 细胞特异性敲除 肝星状细胞 基因鉴定 繁育

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基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

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作者 杨坤 章容 +4 位作者 吴越 雷小平 谌云川 康兰 董文斌 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2025年第14期2943-2950,共8页

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP... 背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre+/+小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre+/+或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。 展开更多

关键词 SENP1 cre-loxp重组酶系统 肺泡Ⅱ型上皮细胞 条件性基因敲除 小鼠

FKBP38肝脏特异敲除小鼠模型的构建 被引量：6

3

作者 王帅 赖姨梅 +2 位作者 林艳 李晓曦 赵子建 《现代生物医学进展》 CAS 2017年第26期5001-5006,共6页

目的:构建FKBP38(FK506 Binding Protein 38)基因肝脏特异敲除小鼠。方法:利用胚胎注射法构建在FKBP38上携带lox P位点的转基因小鼠。在FKBP38基因位置携带lox P位点的小鼠的基础上,以肝脏实质细胞特异性表达的Alb-Cre介导FKBP38条件性... 目的:构建FKBP38(FK506 Binding Protein 38)基因肝脏特异敲除小鼠。方法:利用胚胎注射法构建在FKBP38上携带lox P位点的转基因小鼠。在FKBP38基因位置携带lox P位点的小鼠的基础上,以肝脏实质细胞特异性表达的Alb-Cre介导FKBP38条件性敲除,以获得FKBP38基因肝脏特异敲除小鼠模型Alb-Cre:FKBP38^(fl/fl)。同时对FKBP38特异性敲除鼠进行鉴定。结果:(1)FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38^(-/-)肝脏中FKBP38基因的m RNA水平相对于同年龄同窝野生型小鼠具有统计学差异(P<0.001)。(2)FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38^(-/-)肝脏中FKBP38基因的蛋白表达水平相对于同年龄同窝野生型小鼠具有统计学差异(P<0.001)。(3)FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38^(-/-)肝脏中,转录和翻译相关蛋白水平未见显著差异,p70 S6K的磷酸化水平轻微上调,4EBP-1的磷酸化水平有轻微下调。(4)FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38^(-/-)肝脏中,凋亡相关蛋白Bcl-2未见差异化表达。结论:FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38^(-/-)肝脏中,FKBP38基因的m RNA和蛋白基本不表达,提示成功构建FKBP38基因肝脏特异敲除小鼠。 展开更多

关键词 FKBP38 肿瘤 条件性敲除 cre/LOX P重组酶系统

原文传递

FKBP38蛋白对子宫内膜癌前期病变的影响及其机制研究

4

作者 闫云静 穆云萍 +2 位作者 王帅 赵子建 李芳红 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1320-1325,共6页

目的构建子宫特异敲除FKBP38小鼠模型,探究FKBP38对于小鼠子宫内膜癌前期病变的影响及其作用机制。方法通过胚胎注射法使小鼠FKBP38基因上携带loxP位点,构建转基因小鼠模型。在此基础上,以在子宫特异表达的孕酮受体启动子Pgr-Cre小鼠介... 目的构建子宫特异敲除FKBP38小鼠模型,探究FKBP38对于小鼠子宫内膜癌前期病变的影响及其作用机制。方法通过胚胎注射法使小鼠FKBP38基因上携带loxP位点,构建转基因小鼠模型。在此基础上,以在子宫特异表达的孕酮受体启动子Pgr-Cre小鼠介导FKBP38条件性敲除,以获得FKBP38子宫特异敲除小鼠模型Pgr-Cre;FKBP38^(fl/fl)。通过PCR及Western blot对子宫特异敲除FKBP38小鼠进行鉴定;通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)检测小鼠子宫敲除FKBP38后组织病理性变化;通过Western blot技术检测小鼠子宫敲除FKBP38后对mTOR通路的影响。结果小鼠子宫特异敲除FKBP38后子宫中FKBP38蛋白表达水平明显降低,与同年龄同窝小鼠相比,差异有统计学意义(P<0.01)。在己烯雌酚刺激下,小鼠18月龄时,子宫特异敲除FKBP38小鼠中16.7%(1/6)发生复杂性非典型性增生(complex atypical hyperplasia,CAH),33.3%(2/6)发生简单性增生(simple hyperplasia,SH)。此外,子宫特异敲除FKBP38小鼠子宫中AKT、S6及4E-BP-1蛋白的磷酸化水平明显升高。结论子宫特异敲除FKBP38小鼠子宫中FKBP38蛋白明显降低,表明小鼠子宫特异敲除模型构建成功。此外,子宫特异敲除FKBP38后,小鼠发生SH以及CAH,表明FKBP38可能与子宫内膜癌癌前病变相关。这可能与FKBP38调控mTOR通路关键性蛋白Akt、S6及4E-BP-1蛋白的磷酸化相关。 展开更多

关键词 FKBP38 子宫内膜癌 条件性敲除 cre/loxp重组酶系统 转基因小鼠 MTOR

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Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定 被引量：2

5

作者 李奇 卢晶 +2 位作者 朱晓蓉 熊枫然 杨金奎 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2020年第1期14-20,共7页

目的构建Cre重组酶系统调控的Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠,为Unc13基因在胰岛素分泌中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法运用CRISPR/Cas9技术构建Unc13 flox/flox转基因小鼠,将其与胰岛β细胞特异... 目的构建Cre重组酶系统调控的Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠,为Unc13基因在胰岛素分泌中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法运用CRISPR/Cas9技术构建Unc13 flox/flox转基因小鼠,将其与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶(Ins2-cre)工具鼠进行杂交,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和测序等方法对其子代小鼠的基因型进行鉴定,并对该基因敲除(knock out,KO)小鼠及其同窝野生(wild type,WT)小鼠的体质量、糖耐量、胰岛素分泌水平进行测定。结果成功构建胰岛β细胞特异性Unc13基因条件性敲除小鼠(以下简称为Unc13 KO鼠)。进一步研究显示Unc13 KO鼠与WT鼠相比,体质量无明显变化,但糖耐量受损,胰岛素第一时相分泌下降。结论成功构建了Unc13基因胰岛β细胞条件敲除小鼠动物模型,为探讨Unc13基因在糖尿病发生、发展中的作用提供研究平台。 展开更多

关键词 基因敲除 cre-loxp重组酶系统 胰岛素分泌 Unc13基因

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Prrx1+牙周膜干细胞在牙移动过程中的谱系示踪

6

作者 汪席均 金安婷 +5 位作者 黄湘如 徐弘远 高昕 杨屹羚 代庆刚 江凌勇 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1008-1015,共8页

目的·通过Cre/loxP重组酶系统研究牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中配对相关同源基因1(paired related homeobox 1,Prrx1)阳性细胞谱系(Prrx1+细胞谱系)在小鼠牙移动过程中的动态分布。方法·利用Cre/l... 目的·通过Cre/loxP重组酶系统研究牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中配对相关同源基因1(paired related homeobox 1,Prrx1)阳性细胞谱系(Prrx1+细胞谱系)在小鼠牙移动过程中的动态分布。方法·利用Cre/loxP重组酶系统,将诱导型Prrx1-Cre^(ERT2)小鼠与R26^(tdTomato)荧光标记小鼠交配繁殖,并通过PCR对其子代小鼠进行基因型鉴定。取8只子代小鼠,向其腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen,TA),以标记PDLSCs中的Prrx1+细胞谱系(即tdTomato^(+)细胞)。于小鼠上颌左侧安置加力装置[即正畸牙移动(orthodontics tooth movement,OTM)侧],右侧未加力即为对照侧,以构建小鼠OTM模型。分别于牙移动第3日(OTM 3 d)、第7日(OTM 7 d)时处死小鼠,收集其双侧上颌磨牙及周围牙周组织,经脱钙后行包埋及冰冻切片处理。采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)观察张力区和压力区牙周膜的改变,并利用免疫荧光染色观察Prrx1+细胞谱系在张力区及压力区的动态分布。结果·经PCR鉴定,子代小鼠基因型为Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)。随着加力装置作用的增加,OTM 7 d小鼠的牙移动距离[(87.44±4.02)μm]较OTM 3 d小鼠[(42.81±5.04)μm]明显增加,提示小鼠OTM模型构建成功。H-E染色结果显示:OTM 3 d时小鼠OTM侧压力区的牙周膜被压缩、间隙变窄,而OTM 7 d时OTM侧牙周膜宽度逐渐恢复;OTM 3 d时OTM侧张力区的牙周膜被拉伸,而OTM 7 d较OTM 3 d时牙周膜排列更规则。免疫荧光染色结果显示:OTM 3 d时OTM侧压力区牙周膜中tdTomato^(+)细胞数量较对照侧减少,OTM 7 d时OTM侧压力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧增加(均P<0.05);OTM 3 d及OTM 7 d时,OTM侧张力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧均有增加(均P<0.05)。结论·成功构建了Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)小鼠的OTM模型,并初步证实了Prrx1+细胞谱系参与OTM过程中的牙周改建。 展开更多

关键词 细胞谱系示踪 正畸牙移动 配对相关同源基因1 cre/loxp重组酶系统

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应用Cre-loxP系统构建肝组织特异性ATF5基因敲除小鼠模型 被引量：1

7

作者 白思益 陈会 +3 位作者 帕梅拉·帕尔哈提 邓晴 朱建伟 袁运生 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1609-1614,共6页

应用Cre-loxP重组酶系统构建肝组织特异性ATF5基因敲除小鼠(ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(+/-))模型。采用Alb-Cre工具鼠,用带有Cre-loxP系统的ATF5 Flox纯合子小鼠(ATF5^(Flox/Flox))和带有Alb-Cre杂合子(Alb-Cre^(+/-))的转基因小鼠进... 应用Cre-loxP重组酶系统构建肝组织特异性ATF5基因敲除小鼠(ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(+/-))模型。采用Alb-Cre工具鼠,用带有Cre-loxP系统的ATF5 Flox纯合子小鼠(ATF5^(Flox/Flox))和带有Alb-Cre杂合子(Alb-Cre^(+/-))的转基因小鼠进行杂交,对产生的子代利用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)进行基因型鉴定。筛选出子代ATF5^(Flox/-)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,其与ATF5^(Flox/Flox)小鼠进一步交配可获得ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,该基因型小鼠的肝细胞基因组中ATF5的外显子缺失。选取雌性、7~8周龄的ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(+/-)和ATF5^(Flox/Flox)-Alb-Cre^(-/-)小鼠各3只,采用实时荧光定量PCR测定ATF5在肝、肾、心和脑组织中的表达量,并采用常规苏木精-伊红(HE)染色,观察2种小鼠各脏器的组织形态。结果表明,该系统可实现ATF5在肝脏中的特异性敲除,敲除效率可达到97%。此外,2种小鼠的肝、肾、肺、心和脑组织形态无明显改变,可为研究ATF5在肝脏中的生物学功能提供体内模型参考。 展开更多

关键词 转录激活因子5 cre-loxp重组酶系统 组织特异性敲除 基因型鉴定

原文传递

Cre-LoxP技术构建肝脏特异性HIF-2α基因敲除小鼠模型 被引量：1

8

作者 赵安竹 付辉蓉 +2 位作者 李昀 陈坚娣 鲁红云 《中华肝脏外科手术学电子杂志》 CAS 2019年第3期270-275,共6页

目的探讨采用Cre-LoxP技术构建肝脏特异性HIF-2α基因敲除小鼠模型的可行性。方法由美国Jackson实验室引进loxP标记的HIF-2α基因小鼠,采用Cre/loxP重组酶系统和Alb-Cre转基因小鼠,通过多次繁殖杂交,建立肝脏特异性HIF-2α基因敲除小鼠... 目的探讨采用Cre-LoxP技术构建肝脏特异性HIF-2α基因敲除小鼠模型的可行性。方法由美国Jackson实验室引进loxP标记的HIF-2α基因小鼠,采用Cre/loxP重组酶系统和Alb-Cre转基因小鼠,通过多次繁殖杂交,建立肝脏特异性HIF-2α基因敲除小鼠模型。利用PCR技术鉴别小鼠基因型,并用RT-qPCR检测小鼠肝脏、脂肪及肌肉组织HIF-2αmRNA水平,同时检测野生型小鼠和Alb-Cre^+/HIF-2α^(fl/fl)的纯合子小鼠血糖、血脂以及肝功能水平。3组HIF-2αmRNA数据比较采用单因素方差分析和Turkey检验。结果 PCR法成功检测出子代小鼠基因型,包括Alb-Cre^+/HIF-2α^(fl/fl)和Alb-Cre^-/HIF-2α^(fl/fl)纯合子小鼠。肝脏HIF-2α基因敲除鼠肝脏组织HIF-2αmRNA表达量为0.10±0.02,明显低于野生型小鼠的1.00±0.10(HSD=-1.87,P<0.05)。结论采用Cre-LoxP技术可成功构建肝脏特异性HIF-2α基因敲除小鼠。 展开更多

关键词 缺氧诱导因子2 α亚基 小鼠 基因敲除 cre/loxp重组酶系统 脂肪肝 非酒精性

原文传递

利用Pdl1敲除的巨噬细胞转录谱分析结核感染中PD-L1作用相关的候选基因

9

作者 石亚男 唐军 +2 位作者 李军丽 王杰 占玲俊 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2020年第5期31-39,共9页

目的分析结核菌(Mtb)感染的程序性死亡配体1(Pdl1)特异性敲除的巨噬细胞(MΦ)转录谱变化,筛选MΦ内PD-L1作用相关的候选基因。方法构建敲除小鼠(Pdl1^Flox/-),通过Cre-loxp技术培育出MΦ上Pdl1特异性敲除的纯合和杂合小鼠(Pdl1^Flox/Flo... 目的分析结核菌(Mtb)感染的程序性死亡配体1(Pdl1)特异性敲除的巨噬细胞(MΦ)转录谱变化,筛选MΦ内PD-L1作用相关的候选基因。方法构建敲除小鼠(Pdl1^Flox/-),通过Cre-loxp技术培育出MΦ上Pdl1特异性敲除的纯合和杂合小鼠(Pdl1^Flox/Flox-Cre,Pdl1^Flox/--Cre),用PCR和流式细胞术验证。分离上述小鼠腹腔MΦ,利用转录组测序技术检测Mtb感染MΦ24 h的表达谱,以同窝阴性小鼠(Pdl1^Flox/Flox)为对照,进行生物信息学分析。结果PCR和流式细胞术证实小鼠敲除成功。纯合、杂合及同窝阴性小鼠感染前后相比,差异表达基因最显著富集项为参与免疫反应和免疫过程的GO(P<0.01;P<0.01),筛出17个PD-L1相关的候选基因。通过KEGG富集分析,最显著富集的通路有Toll样受体、NF-κB信号通路等(P<0.01;P<0.01),筛出6个候选基因。结论通过转录谱分析,确定与免疫反应及免疫过程有关的Ccl2、Qa5、Il12a等17个基因,免疫及炎症相关代谢通路的Ptgs2、Cd40、Card11等6个基因为Mtb感染的MΦ内PD-L1相关的候选基因,除Il6外均为本研究新筛选的候选基因。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 巨噬细胞 Pdl1基因敲除 cre/loxp重组酶系统 转录组测序

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基于Cre/Loxp重组酶系统的谱系示踪技术在成骨改建研究中的应用进展

10

作者 徐宁蔚 王晶 +3 位作者 龚佳静 张瑾 金安婷 江凌勇 《中国口腔颌面外科杂志》 CAS 2021年第6期562-567,共6页

细胞谱系示踪技术是研究干细胞特性的重要工具,基于Cre/Loxp重组酶系统的谱系示踪技术是示踪方法的一大突破,组成性重组酶系统实现了报告基因的组织特异性,诱导性重组酶系统在此基础上实现了报告基因表达时间的可控性。研究成骨改建机... 细胞谱系示踪技术是研究干细胞特性的重要工具,基于Cre/Loxp重组酶系统的谱系示踪技术是示踪方法的一大突破,组成性重组酶系统实现了报告基因的组织特异性,诱导性重组酶系统在此基础上实现了报告基因表达时间的可控性。研究成骨改建机制涉及成骨细胞系命运,对骨改建研究、组织工程学应用是有重要意义。本文综述了基于Cre/Loxp重组酶系统的谱系示踪技术在研究成骨系细胞分化、来源、转归及其在发育和修复中的功能等方面的应用,并探讨其适用范围、优势和不足。 展开更多

关键词 谱系示踪 成骨改建 cre/loxp重组酶系统

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肢芽间充质干细胞条件性FKBP38基因敲除小鼠模型的构建

11

作者 胡乐 李禹杨 +2 位作者 柯志勇 张月 张武锔 《分子影像学杂志》 2019年第1期67-69,共3页

目的构建并鉴定条件性肢芽间充质干细胞FKBP38基因敲除小鼠,为研究FKBP38基因在骨发育及骨关节炎中的作用机制提供动物模型。方法将Prrx1-Cre小鼠与FKBP38^(flox/flox)交配繁殖出F1代小鼠,得到基因型为Prrx1-Cre(Fkbp38^(flox/+))小鼠;... 目的构建并鉴定条件性肢芽间充质干细胞FKBP38基因敲除小鼠,为研究FKBP38基因在骨发育及骨关节炎中的作用机制提供动物模型。方法将Prrx1-Cre小鼠与FKBP38^(flox/flox)交配繁殖出F1代小鼠,得到基因型为Prrx1-Cre(Fkbp38^(flox/+))小鼠;选基因型Prrx1-Cre(Fkbp38^(flox/+))的小鼠与FKBP38^(flox/flox)小鼠杂交获得F2代小鼠;基因型为Prrx1-Cre(Fkbp38^(flox/flox))的小鼠即为本实验所需要构建模型小鼠。3周龄鉴定小鼠基因型,4周龄时用Western blot验证FKBP38基因敲除效果。结果 F2代小鼠中包含基因敲除鼠,PCR结果显示基因型为Cre/FKBP38^(flox/flox),Western blot结果显示FKBP38基因敲除效果明显。结论基于Cre/loxp重组酶系统,繁殖出肢芽间充质干细胞FKBP38基因敲除鼠,为在动物水平上探究FKBP38在骨发育及骨关节炎的作用机制提供模型基础。 展开更多

关键词 肢芽间充质干细胞 FKBP38 cre/loxp重组酶系统

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用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系 被引量：3

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作者 綦世金 毕延震 +6 位作者 刘西梅 华文君 郑新民 李奎 唐中林 华再东 陈彬 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期311-318,共8页

肌肉生长抑制素(myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位... 肌肉生长抑制素(myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204bp的外显子3序列,LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。 展开更多

关键词 猪肌肉抑制素双等位基因敲除 CRISPR/Cas9 cre/LOX P重组酶删除系统

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