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构建反转录病毒小向导RNA表达载体用于小鼠T细胞基因功能研究
被引量：
1
1
作者
赵艳娜
邱荣
+1 位作者
沈南
唐元家
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第12期1585-1590,共6页
目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后...
目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后,回收得到反转录病毒载体骨架。以慢病毒sgRNA表达载体为模版,通过PCR扩增获得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重组将U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段组装进反转录病毒载体骨架。为了验证系统的有效性,设计靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并进行克隆。分离Cas9转基因小鼠CD4 T细胞分别进行sgRNA反转录病毒感染,诱导其向Th17细胞分化。细胞因子染色,流式检测Il17a阳性细胞比例。2组独立样本数据比较采用非配对t检验。结果·①成功构建反转录病毒sgRNA载体。②利用反转录病毒载体向小鼠CD4 T细胞递送sgRNA并实现Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA阳性群体中,Il17a阳性群体比率显著降低(P<0.05)。结论·利用sgRNA反转录病毒载体成功向目的细胞递送sgRNA并实现基因敲除。Rorc和Irf4基因敲除结果提示该系统可用于小鼠T细胞基因功能研究。
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关键词
CRISPR/
cas
9
cas
9
转基因
小鼠
反
转
录病毒载体
TH17细胞分化
下载PDF
职称材料
LSL-Cas9小鼠永生化胚胎成纤维细胞系的构建及应用
2
作者
张言
包明月
+5 位作者
韩冰
田梦园
杨亚娜
冯晨昱
李星
张媛
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第9期42-52,共11页
目的:利用猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)Large T(LT)抗原慢病毒转染含有LoxP-Stop-LoxP(LSL)元件的Cas9转基因小鼠(LSL-Cas9)胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),建立永生化LSL-Cas9小鼠MEF系并用于sgRNA剪切效率的高...
目的:利用猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)Large T(LT)抗原慢病毒转染含有LoxP-Stop-LoxP(LSL)元件的Cas9转基因小鼠(LSL-Cas9)胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),建立永生化LSL-Cas9小鼠MEF系并用于sgRNA剪切效率的高效验证。克服由于Cas9序列过大而引起的转染效率低的问题,构建一种用于sgRNA剪切效率验证的经济、便捷、高效工具。方法:以LSL-Cas9胎鼠为实验动物,分离其MEF并感染SV40 LT慢病毒;利用潮霉素筛选成功转化的细胞;通过免疫荧光检测成纤维细胞标志物表达和细胞衰老情况,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定SV40 LT抗原基因在MEF中的整合情况,建立永生化无限增殖细胞系;以IL10Rα基因为例验证该系统的可行性:设计4种sgRNA,利用含有PU6-sgRNA串联PCSP-Cre基因表达盒的质粒转化永生化LSL-Cas9小鼠MEF系;通过T7内切核酸酶I(T7 endonuclease I,T7EI)法评估sgRNA的剪切效率,挑选靶向性最优的sgRNA。结果:经潮霉素筛选的阳性细胞扩大培养并稳定传代至60代,具备永生化无限增殖细胞系的特点;经PCR鉴定,SV40 LT抗原基因已稳定整合至MEF基因组中;T7EI酶切法证实sgRNA有效引导Cas9内切核酸酶实现了靶基因的切割,4种sgRNA的基因编辑效率分别为28.17%、45.87%、33.61%、38.62%。结论:SV40 LT抗原基因介导的永生化无限增殖LSL-Cas9 MEF系构建成功,可实现sgRNA引导Cas9剪切效率的高效快速验证。
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关键词
LSL-
cas
9
转基因
小鼠
永生化细胞系
SV40
LT抗原
T7EI
原文传递
题名
构建反转录病毒小向导RNA表达载体用于小鼠T细胞基因功能研究
被引量：
1
1
作者
赵艳娜
邱荣
沈南
唐元家
机构
上海交通大学医学院附属仁济医院风湿病科
中国科学院大学上海营养与健康研究所
出处
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第12期1585-1590,共6页
基金
国家自然科学基金(81871287,31630021)
上海交通大学医学院高水平地方高校创新团队(SSMU-ZDCX20180100)。
文摘
目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后,回收得到反转录病毒载体骨架。以慢病毒sgRNA表达载体为模版,通过PCR扩增获得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重组将U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段组装进反转录病毒载体骨架。为了验证系统的有效性,设计靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并进行克隆。分离Cas9转基因小鼠CD4 T细胞分别进行sgRNA反转录病毒感染,诱导其向Th17细胞分化。细胞因子染色,流式检测Il17a阳性细胞比例。2组独立样本数据比较采用非配对t检验。结果·①成功构建反转录病毒sgRNA载体。②利用反转录病毒载体向小鼠CD4 T细胞递送sgRNA并实现Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA阳性群体中,Il17a阳性群体比率显著降低(P<0.05)。结论·利用sgRNA反转录病毒载体成功向目的细胞递送sgRNA并实现基因敲除。Rorc和Irf4基因敲除结果提示该系统可用于小鼠T细胞基因功能研究。
关键词
CRISPR/
cas
9
cas
9
转基因
小鼠
反
转
录病毒载体
TH17细胞分化
Keywords
CRISPR/
cas
9
cas
9
transgenic mouse
retroviral vector
Th17 cell differentiation
分类号
R593.24 [医药卫生—内科学]
下载PDF
职称材料
题名
LSL-Cas9小鼠永生化胚胎成纤维细胞系的构建及应用
2
作者
张言
包明月
韩冰
田梦园
杨亚娜
冯晨昱
李星
张媛
机构
陕西师范大学生命科学学院
出处
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第9期42-52,共11页
基金
国家自然科学基金(9226811882271199)资助项目。
文摘
目的:利用猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)Large T(LT)抗原慢病毒转染含有LoxP-Stop-LoxP(LSL)元件的Cas9转基因小鼠(LSL-Cas9)胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),建立永生化LSL-Cas9小鼠MEF系并用于sgRNA剪切效率的高效验证。克服由于Cas9序列过大而引起的转染效率低的问题,构建一种用于sgRNA剪切效率验证的经济、便捷、高效工具。方法:以LSL-Cas9胎鼠为实验动物,分离其MEF并感染SV40 LT慢病毒;利用潮霉素筛选成功转化的细胞;通过免疫荧光检测成纤维细胞标志物表达和细胞衰老情况,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定SV40 LT抗原基因在MEF中的整合情况,建立永生化无限增殖细胞系;以IL10Rα基因为例验证该系统的可行性:设计4种sgRNA,利用含有PU6-sgRNA串联PCSP-Cre基因表达盒的质粒转化永生化LSL-Cas9小鼠MEF系;通过T7内切核酸酶I(T7 endonuclease I,T7EI)法评估sgRNA的剪切效率,挑选靶向性最优的sgRNA。结果:经潮霉素筛选的阳性细胞扩大培养并稳定传代至60代,具备永生化无限增殖细胞系的特点;经PCR鉴定,SV40 LT抗原基因已稳定整合至MEF基因组中;T7EI酶切法证实sgRNA有效引导Cas9内切核酸酶实现了靶基因的切割,4种sgRNA的基因编辑效率分别为28.17%、45.87%、33.61%、38.62%。结论:SV40 LT抗原基因介导的永生化无限增殖LSL-Cas9 MEF系构建成功,可实现sgRNA引导Cas9剪切效率的高效快速验证。
关键词
LSL-
cas
9
转基因
小鼠
永生化细胞系
SV40
LT抗原
T7EI
Keywords
LSL-
cas
9
transgenic mice
Immortalized cell lines
SV40 LT antigen
T7EI
分类号
Q291 [生物学—细胞生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
构建反转录病毒小向导RNA表达载体用于小鼠T细胞基因功能研究
赵艳娜
邱荣
沈南
唐元家
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2020
1
下载PDF
职称材料
2
LSL-Cas9小鼠永生化胚胎成纤维细胞系的构建及应用
张言
包明月
韩冰
田梦园
杨亚娜
冯晨昱
李星
张媛
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2024
0
原文传递
已选择
0
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