活化转录因子3基因Cas9编辑慢病毒载体的构建及鉴定

1

作者 周绍酉 周宁 +6 位作者 张魁 李扬 赵洋 宋邦荣 郑居兵 刘涛帅 董然 《心肺血管病杂志》 2019年第7期799-804,共6页

目的:构建靶向活化转录因子3(ATF3)在CRISPR/Cas9技术编辑的慢病毒载体。方法:针对ATF3基因设计并合成三条对应的向导(gRNA)序列和一条无意义序列,向导RNA序列与双酶切U6-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-EGFP载体链接,DNA测序鉴定重组载体。荧光/... 目的:构建靶向活化转录因子3(ATF3)在CRISPR/Cas9技术编辑的慢病毒载体。方法:针对ATF3基因设计并合成三条对应的向导(gRNA)序列和一条无意义序列,向导RNA序列与双酶切U6-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-EGFP载体链接,DNA测序鉴定重组载体。荧光/绝对定量法测定慢病毒浓度。共转染人微血管静脉内皮细胞(HMEC)后,实时定量荧光PCR检测ATF3mRNA表达,验证HMEC细胞中是否含有ATF3基因及其是否有突变。对照病毒和三个靶点慢病毒分别感染Cas9蛋白稳定株,感染后混合克隆进行抽提基因组DNA,将得到PCR产物进行错配酶法进行酶切,对于筛靶中阳性的PCR产物一组序列与野生型对比。Westernblot检测ATF3蛋白表达,验证转染效果。定量PCR检测ATF3mRNA的改变。结果:测序表明ATF3在Cas9编辑下慢病毒载体构建成功。HMEC倒置荧光显微镜荧光视野和明视野进行对比,感染可达到80%转染率,GFP持续稳定表达。Westernblot结果显示,ATF3蛋白表达有明显下调(P<0.05)。结论:本研究成功构建了ATF3Cas9编辑慢病毒载体,为进一步研究ATF3在静脉桥血管再狭窄中早期内皮功能失调作用机制及基因治疗提供了实验依据。 展开更多

关键词 冠状动脉旁路移植术 静脉桥血管再狭窄 活化转录因子3 cas9基因编辑技术

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CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床研究中的伦理审查问题探讨 被引量：14

2

作者 周吉银 刘丹 +1 位作者 曾圣雅 周来新 《中国医学伦理学》 2017年第8期927-931,共5页

目的探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床研究中引发的伦理审查问题,为临床研究中涉及该技术的伦理审查注意事项提供参考。方法总结国内外CRISPR/Cas9基因编辑技术存在的伦理问题,分析其原因并提出符合我国国情新技术应用的建议。结果应... 目的探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床研究中引发的伦理审查问题,为临床研究中涉及该技术的伦理审查注意事项提供参考。方法总结国内外CRISPR/Cas9基因编辑技术存在的伦理问题,分析其原因并提出符合我国国情新技术应用的建议。结果应该允许将基因编辑技术应用于体细胞基因治疗,禁止用于生殖系基因治疗和不考虑用来增强;鉴于CRISPR/Cas9缺乏明确的责任伦理主体,带来安全性、权利冲突和社会公平问题,需采取的措施包括加强文化沟通、尽快形成基因编辑技术伦理规范、在国家层面上设立独立的基因编辑技术项目伦理审查机构、健全法律规范、制定技术标准和伦理准则以及在国家层面应对基因编辑研究领域进行重点支持。结论鉴于CRISPR/Cas9技术潜在的临床应用,国家应逐步从禁止到限制性开展人类胚胎基因编辑技术的研究。伦理委员会要负起临床研究的伦理审查和监管。伦理委员会委员和伦理工作人员应加强相关新知识的学习,从受理涉及CRISPR/Cas9技术的临床科研项目到伦理审查都严格对接政策法规,确保有效审查基因编辑技术项目的伦理问题。 展开更多

关键词 CRISPR/cas9基因编辑技术 临床研究 伦理审查

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利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性 被引量：8

3

作者 周天顺 余东 +4 位作者 刘玲 欧阳宁 袁贵龙 段美娟 袁定阳 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期11-18,共8页

【目的】为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。【方法】以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。【结果】AFP1靶点1和靶点2的编... 【目的】为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。【方法】以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。【结果】AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变(<5 bp)。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。【结论】编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。 展开更多

关键词 水稻 CRISPR/cas9基因编辑技术 AFP1 耐逆性

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罕见病的基因治疗应用与展望 被引量：7

4

作者 桂怡婷 李强 桂永浩 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期794-798,共5页

罕见病发病率极低、但大多病情严重且好发于儿童时期,多由遗传变异所引起。因患者数少、市场需求低,罕见病药物的研发成本极高,有药可治的罕见病仅不足1%。随着基因诊断技术进步,基因治疗凭借其“一次性彻底治愈”的特点,为遗传性罕见... 罕见病发病率极低、但大多病情严重且好发于儿童时期,多由遗传变异所引起。因患者数少、市场需求低,罕见病药物的研发成本极高,有药可治的罕见病仅不足1%。随着基因诊断技术进步,基因治疗凭借其“一次性彻底治愈”的特点,为遗传性罕见病患者带来了希望。本文介绍罕见病的基因治疗现状,论述传统基因递送技术和以CRISPR-Cas 9为代表的基因编辑技术在罕见病中的应用及发展。 展开更多

关键词 罕见病 基因治疗 基因递送技术 CRISPR-cas9基因编辑技术

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CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用 被引量：7

5

作者 孟泽松 王飞飞 +2 位作者 王光林 席金川 王贵英 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1395-1401,共7页

规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPRassociated nuclease 9,Cas 9)基因编辑技术是新涌现的一种基因编辑技术,它能精准完成RNA导向的DNA识别及编辑... 规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPRassociated nuclease 9,Cas 9)基因编辑技术是新涌现的一种基因编辑技术,它能精准完成RNA导向的DNA识别及编辑,为构建更高效的基因编辑技术提供了可能,目前科研人员已经可以实现在碱基水平对基因进行定点修饰。CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于肿瘤研究中。本文对CRISPR/Cas 9基因编辑技术在基因编辑中的分子机制及其在临床治疗和肿瘤研究中应用的研究进展进行综述。 展开更多

关键词 肿瘤 基因治疗 CRISPR/cas9基因编辑技术

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香菇中CRISPR/Cas9基因编辑体系的构建

6

作者 付阳 宋春艳 +6 位作者 董晶晶 刘建雨 姜宁 章炉军 于海龙 尚晓冬 谭琦 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期23-39,共17页

香菇Lentinula edodes是世界第二大食药用菌,具有较高的食用、药用、经济和生态学研究价值,探索其本身具备优良性状的调控机制,同时对可能参与其中的功能基因进行反义遗传学研究是十分必要的。本研究对已知的功能基因利用CRISPR/Cas9基... 香菇Lentinula edodes是世界第二大食药用菌,具有较高的食用、药用、经济和生态学研究价值,探索其本身具备优良性状的调控机制,同时对可能参与其中的功能基因进行反义遗传学研究是十分必要的。本研究对已知的功能基因利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行编辑,确定该技术能在香菇中工作。预测并筛选出一个香菇U6snRNA启动子,以乳清苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因pyrG为目的基因设计CRISPR/Cas9技术的重要工作元件sgRNA,对异源cas9基因依据香菇基因组密码子偏好性进行优化,构建了一个同时携带sgRNA和cas9基因的双元表达载体。利用农杆菌介导的香菇菌丝遗传转化技术将该载体转入香菇单核体中对pyrG基因进行编辑,成功获得pyrG基因发生碱基缺失的香菇单核体突变株,经功能筛选后确定其为尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株。本研究成功构建了一个能同时表达CRISPR/Cas9技术重要组件的双元表达载体,证明了CRISPR/Cas9能够在香菇中发挥编辑目的基因的功能,为进一步开展香菇重要功能基因的研究奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 香菇 CRISPR/cas9基因编辑技术 pyrG基因 尿嘧啶营养缺陷型 功能基因

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SLC5A8基因敲除后皮下种植结肠癌细胞株的负瘤模型小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群占比观察

7

作者 刘雅涵 吴育朔 +2 位作者 赵泽满 蔡思源 靳小石 《山东医药》 CAS 2023年第21期50-53,共4页

目的观察SLC5A8基因敲除后皮下种植结肠癌细胞株MC-38的负瘤模型小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群占比变化,为结肠癌基因治疗提供实验依据。方法应用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建SLC5A8基因敲除型C57BL/6小鼠,记为实验组。将普通C57BL/6... 目的观察SLC5A8基因敲除后皮下种植结肠癌细胞株MC-38的负瘤模型小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群占比变化,为结肠癌基因治疗提供实验依据。方法应用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建SLC5A8基因敲除型C57BL/6小鼠,记为实验组。将普通C57BL/6小鼠记为对照组。将两组小鼠皮下种植结肠癌细胞株MC-38细胞悬液制备MC-38负瘤模型,制备成功后完整剥离肿瘤组织,采用流式细胞法测算各组小鼠结肠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群占比。结果实验组小鼠肿瘤微环境中CD3^(+)T淋巴细胞、CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞占比分别为27.730%±2.861%、50.923%±4.823%、10.205%±1.234%,对照组小鼠肿瘤微环境中CD3^(+)T淋巴细胞、CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞占比分别为40.790%±9.940%、58.355%±3.292%、22.950%±1.948%,两组相比,P均<0.05。结论与普通C57BL/6小鼠相比,SLC5A8基因敲除后皮下种植MC-38细胞的负瘤模型小鼠肿瘤微环境中CD3^(+)T淋巴细胞、CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞占比均下降。 展开更多

关键词 T淋巴细胞亚群 肿瘤微环境 SLC5A8基因 基因敲除技术 CRISPR/cas9基因编辑技术 负瘤小鼠 动物实验

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fimH基因敲除对大肠杆菌NMGCF-19菌株致病性的影响

8

作者 杨茗崴 王玮玉 +4 位作者 王裕光 胡俊英 张群 张芷源 王新平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1881-1887,共7页

大肠杆菌NMGCF-19菌株由本实验室于2019年从临床上呈现腹泻和神经症状为主要特征的羔羊体内分离获得。前期研究发现该菌株具有突破动物血脑屏障、引起动物脑膜脑炎及组织器官出血与坏死等致病能力。为确定fimH基因与大肠杆菌NMGCF-19菌... 大肠杆菌NMGCF-19菌株由本实验室于2019年从临床上呈现腹泻和神经症状为主要特征的羔羊体内分离获得。前期研究发现该菌株具有突破动物血脑屏障、引起动物脑膜脑炎及组织器官出血与坏死等致病能力。为确定fimH基因与大肠杆菌NMGCF-19菌株致病性的相关性,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对NMGCF-19菌株的fimH基因进行了敲除,并将其培养特性、生物学特性及致病性等与NMGCF-19wild进行了比较研究。PCR扩增基因序列及测序结果显示,应用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除目的基因并构建出fimH基因敲除NMGCF-19菌株,命名为NMGCF-19fimH-。与NMGCF-19wild相比,NMGCF-19fimH-的菌落特征、培养特性、生长曲线没有显著性差异;而相同剂量NMGCF-19fimH-接种小鼠后,引起小鼠的死亡数明显低于野毒株,且致死时间明显延后。病理学与病理组织学检查结果显示,NMGCF-19fimH-感染引起的病理学与病理组织学变化明显轻于NMGCF-19wild,上述结果表明fimH为NMGCF-19大肠杆菌的毒力基因之一。 展开更多

关键词 大肠杆菌 CRISPR/cas9基因编辑技术 基因敲除 fimH基因

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CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状 被引量：3

9

作者 徐瑞平 周雁 边银丙 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期119-127,共9页

大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统... 大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统的结构类型及CRISPR/Cas9系统作用机理,介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状,并针对Cas9和sgRNA的表达、遗传转化策略、靶位点选择等影响编辑效率的关键问题进行了分析讨论,旨在为该技术在大型真菌研究中的应用提供参考。 展开更多

关键词 食用菌 药用菌 CRISPR/cas结构类型 CRISPR/cas9系统作用机理 CRISPR/cas9基因编辑技术应用现状

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基于CRISPR/Cas9基因编辑技术生成靶向识别Her2的B细胞免疫治疗研究

10

作者 罗保红 詹钦茹 李淑华 《热带医学杂志》 CAS 2023年第9期1212-1217,1342,共7页

目的利用规律成簇的间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向识别Her2的B细胞,探究基因编辑B细胞的抗肿瘤免疫治疗作用。方法设计针对B细胞抗原受体(BCR)的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体上,经重组T7... 目的利用规律成簇的间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向识别Her2的B细胞,探究基因编辑B细胞的抗肿瘤免疫治疗作用。方法设计针对B细胞抗原受体(BCR)的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体上,经重组T7核酸内切酶I(T7E1)酶切实验验证sgRNA的切割效率。通过分子克隆技术从曲妥珠单抗基因中调取scFv序列并和同源臂连接在一起,构建到cppt-IRES-GFP慢病毒载体中作为同源重组模板。分别将Cas9/sgRNA表达质粒和同源模板质粒与BaEVTR包膜质粒、psPAX2-D64V骨架质粒包装成整合酶缺陷的慢病毒(IDLV),用2种慢病毒同时感染人原代B细胞进行基因编辑。将基因编辑的B细胞与Her2阳性肿瘤细胞SKBR-3共培养,通过流式检测B细胞的活化和增殖。用293T-CD40L-sBAFF饲养细胞扩增基因编辑的B细胞。从临床生物样本库获取Her2阳性乳腺癌标本构建患者来源的肿瘤类器官模型,评估基因编辑B细胞浸润、清除肿瘤的能力。结果选择IGHD作为打靶位点、切割率最高的sgRNA(约为52%)作为最终的打靶序列。2种IDLV同时感染B细胞后,scFv整合效率明显提高,达到25%,差异有统计学意义(t=6.357,P<0.001)。对基因编辑的B细胞进行基因组PCR的结果显示,scFv基因定点敲入到了靶位点。流式检测基因编辑的B细胞能靶向识别SKBR-3,从而活化并增殖。靶向识别Her2的B细胞与293T-CD40L-sBAFF饲养细胞共培养能迅速大量扩增。Biotek活细胞实时荧光成像系统观测到靶向识别Her2的B细胞浸润、清除肿瘤类器官的能力显著增强。结论本研究成功获得了大量靶向识别Her2的B细胞,在肿瘤类器官模型中靶向识别Her2的B细胞能有效浸润并清除肿瘤。 展开更多

关键词 细胞免疫治疗 CRISPR/cas9基因编辑技术 B细胞 Her2

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拟南芥ACOL8基因在乙烯合成与响应中的功能分析

11

作者 林蓉 郑月萍 +2 位作者 徐雪珍 李丹丹 郑志富 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期157-165,共9页

植物激素乙烯在多种生理生化过程中发挥重要作用,但其在特定组织器官中的合成机制尚不完全清楚。拟南芥中存在12个功能未知的ACC氧化酶类似蛋白(ACO-like homolog,ACOL),运用基因定点编辑技术构建了ACOL8的功能丧失型突变体,发现该基因... 植物激素乙烯在多种生理生化过程中发挥重要作用,但其在特定组织器官中的合成机制尚不完全清楚。拟南芥中存在12个功能未知的ACC氧化酶类似蛋白(ACO-like homolog,ACOL),运用基因定点编辑技术构建了ACOL8的功能丧失型突变体,发现该基因的突变削弱了经典的乙烯“三重反应”。与野生型相比,突变体黄化幼苗下胚轴及主根的长度显著增加,这与突变体对外源ACC的敏感性下降现象一致。同时还发现ACOL8基因的表达受乙烯信号的正反馈调控,EIN3过表达增强其表达水平,而etr1-3的突变则产生相反效应。再者,在正常条件下,ACOL8基因的突变并未影响拟南芥的生长;但在盐胁迫条件下,突变体的根冠比显著下降,这说明该基因参与植物的盐胁迫响应。综上,这些结果说明ACOL8可能具有ACC氧化酶的功能,参与乙烯的合成与响应。 展开更多

关键词 ACC氧化酶类似蛋白 CRISPR/cas9基因编辑技术 乙烯合成 耐盐性 拟南芥

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探讨MSX1基因缺失导致的牙发育异常的机制及可能的信号通路 被引量：3

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作者 周勇 朱明会 +2 位作者 黄旭瑶 邵海宾 郑树灿 《临床口腔医学杂志》 2021年第12期716-719,共4页

目的:探讨MSX1基因缺失导致的牙发育异常的机制及可能的信号途径。方法:体外培养成牙本质细胞系MDPC-23,加入地塞米松(DEX),根据0、2、4、16、24 h时间节点完成细胞收集,采用荧光定量PCR测定细胞中MSX1、ALP、OC及MMP-2 mRNA表达水平。... 目的:探讨MSX1基因缺失导致的牙发育异常的机制及可能的信号途径。方法:体外培养成牙本质细胞系MDPC-23,加入地塞米松(DEX),根据0、2、4、16、24 h时间节点完成细胞收集,采用荧光定量PCR测定细胞中MSX1、ALP、OC及MMP-2 mRNA表达水平。采用CRISP R-as9基因编辑技术对构建MSX1基因敲除小鼠成牙本质细胞进行精密编辑,设为观察组;选择成牙本质细胞系MDPC-23为对照组。采用实时荧光PCR和Wertern Blot法测定两组细胞中MSX1基因、ALP、OC及MMP-2蛋白水平。结果:成牙本质细胞系MC3T3-ET随着培养时间的延长MSX1基因、ALP、OC及MMP-2基因表达存在明显差异性。MSX1基因、ALP、OC及MMP-2基因培养12 h表达量均高于0、6、16及24 h(P<0.05)。观察组MSX1基因缺失后ALP、OC及MMP-2 mRNA水平均低于对照组(P<0.05);观察组ALP、OC及MMP-2蛋白水平明显下降,均低于对照组(P<0.05)。结论:MSX1基因缺失能引起牙发育异常,其机制可能与ALP、OC、MMP-2蛋白水平下调有关,从而引起相关信号通路途径异常。其机制可能与ALP、OC及MMP-2蛋白水平下调有关,从而引起相关信号通路途径异常。 展开更多

关键词 MSX1基因缺失 牙发育异常 信号途径 CRISP R-cas9基因编辑技术

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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制EV71复制 被引量：3

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作者 吴涛 朱小娟 +7 位作者 樊欢 葛以跃 陈银 郭喜玲 赵康辰 史智扬 朱凤才 崔仑标 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期859-864,共6页

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型（EV71）的特定基因进行编辑，评价其抑制EV71复制的效应。方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝（ MTT）... 目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型（EV71）的特定基因进行编辑，评价其抑制EV71复制的效应。方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝（ MTT）法测定细胞毒性，转染后接种病毒观察细胞病变作用（ CPE），荧光定量RT-PCR法检测EV71含量，免疫共沉淀结合荧光定量RT-PCR法测定 Cas9-gRNA 在细胞内与 EV71 RNA 特异性结合的能力。结果成功构建pCas-Guide-GFP-G1表达质粒；转染细胞后未见明显细胞毒性效应；细胞转染后接种病毒发现pCas-Guide-GFP-G1＋PAM1组细胞病变明显少于其他对照组；培养上清中 EV71含量较对照组降低了40.4%（P=0.056），细胞中 EV71含量较对照组降低了52.8%（P=0.014）；pCas-Guide-GFP-G1＋PAM1组在细胞内与 EV71 RNA 特异性结合能力最高。结论针对 EV71的 VP4基因设计的CRISPR/Cas9表达质粒在特定PAM存在下能通过对EV71基因组的剪切实现抑制EV71病毒复制的作用，可以为EV71治疗提供新的途径。 展开更多

关键词 CRISPR/cas9基因编辑技术 肠道病毒71型 病毒复制 抑制

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通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑SSSⅡb基因改良稻米品质 被引量：3

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作者 蔡梦颖 张平 +7 位作者 宋炜涵 余江峰 郝栖贤 王平 刘世家 王益华 江玲 万建民 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期18-26,共9页

[目的]本文旨在利用基因编辑技术,降低水稻直链淀粉含量,改善稻米食味品质特性,以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合成基因(SSSⅡb)的表达,对转基因家系进行目标... [目的]本文旨在利用基因编辑技术,降低水稻直链淀粉含量,改善稻米食味品质特性,以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合成基因(SSSⅡb)的表达,对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定,选出目标育种材料。[结果]对淀粉合酶基因SSSⅡb进行多靶点编辑,得到3个目标基因敲除的转基因家系,分别为SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系。与‘宁粳4号’相比,SSS2-Q家系直链淀粉含量显著下降,支链淀粉的中等链长减少,胶稠度、热浆黏度和冷浆黏度等指标均优于‘宁粳4号’,品质指标达到预期目标;但每穗实粒数和结实率降低,粒长增加。而在SSS2-Z与SSS2-H家系中,品质指标没有实现预期目标。RT-qPCR分析发现,SSS2-Q家系中SSSⅡb基因表达下调,其他淀粉合成相关基因表达也发生变化。[结论]采用CRISPR/Cas9技术,靶向编辑‘宁粳4号’中SSSⅡb基因,降低SSS2-Q家系直链淀粉含量,品质指标得到改善,为优质食味转基因水稻新品种培育提供新种质。 展开更多

关键词 水稻 直链淀粉 CRISPR/cas9基因编辑技术 淀粉合酶

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CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用 被引量：3

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作者 王韶嵘(综述) 高兴春 +2 位作者 陈芳妮 乔文伟 米亚静(审校) 《实用癌症杂志》 2019年第7期1216-1218,共3页

恶性肿瘤严重威胁着我们的健康,根据国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示,2014年我国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例(男性211.4万例,女性169.0万例),2015年这一数字达到400万。恶性肿瘤是由遗传因素、环境因素及机体免疫系统等在... 恶性肿瘤严重威胁着我们的健康,根据国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示,2014年我国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例(男性211.4万例,女性169.0万例),2015年这一数字达到400万。恶性肿瘤是由遗传因素、环境因素及机体免疫系统等在内的多种因素共同作用下所引发的,其发病机制复杂,目前还不能完全阐明其具体机制。此外,恶性肿瘤的治疗主要依赖于放、化疗及手术治疗,但对于放、化疗均不耐受或已经处于晚期、失去手术机会的患者仍然没有一种有效且具有特异性的治疗方法,这些导致恶性肿瘤患者的治愈率不高且预后极差。CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅猛,具有广泛的应用前景,研究人员开创性地将其应用到肿瘤的研究中,探索复杂的肿瘤表型与基因功能间的关系,为肿瘤的研究及治疗提供了新的技术。 展开更多

关键词 CRISPR/cas9基因编辑技术 恶性肿瘤 基因治疗

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五指山小型猪近交系异种移植产业化研发进展 被引量：3

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作者 冯书堂 戴一凡 +1 位作者 章金刚 潘志强 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期469-473,共5页

为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容。本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-... 为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容。本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-猴异种角膜内皮移植取得突破性进展、WZSP近交系PERV无传染性群体建立、WZSP近交系是理想的动物模型和异种移植供体等方面,介绍WZSP近交系异种移植产业化的研发进展。 展开更多

关键词 五指山小型猪 近交系猪 异种移植 免疫排斥反应 α-1 3-半乳糖基转移酶基因敲除(αGTKO) 猪内源性逆转录病毒(PERV) 非α-1 3-半乳糖(Gal)抗原 CRISPR/cas9基因编辑技术

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利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞Tudor-SN基因对细胞周期的阻滞及增殖的抑制 被引量：2

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作者 甘世虎 崔晓腾 +6 位作者 马锦征 房丽娇 刘明霞 任媛媛 曹晓娜 杨洁 苏超 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期754-759,共6页

基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因... 基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。 展开更多

关键词 CRISPR-cas9基因编辑技术 基因敲除 H9C2细胞 Tudor-SN基因 细胞周期阻滞与增殖

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CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进展 被引量：2

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作者 郭华荣 陶奕文 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期105-112,119,共9页

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种由gRNA(guide RNA)引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术,已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降,其操作简便快速,成本低,已... CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种由gRNA(guide RNA)引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术,已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降,其操作简便快速,成本低,已成为人们探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因以及改良经济物种种质性状的重要工具。目前,该技术已经在少数几种水生甲壳动物中得到成功应用,但是由于显微注射技术在应用上的局限性,该技术在许多重要海水养殖经济物种如对虾中的应用受到限制,导致其基因编辑效率低下,难以广泛开展。本文对CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进行了综述和展望,为今后海水养殖虾蟹类的基因功能研究以及遗传育种研究提供参考。 展开更多

关键词 CRISPR/cas9基因编辑技术 水生甲壳动物 应用 显微注射 基因编辑效率

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CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤治疗方面的研究进展 被引量：2

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作者 程得洛 《系统医学》 2020年第20期195-198,共4页

当前肿瘤疾病依然是威胁人们健康、生活质量的一个重要因素,探寻有效的干预手段来缓解肿瘤疾病发展甚至是治愈肿瘤是临床的重要课题,准确的诊断手段、对病情发展与干预程度的评估是控制病情的前提,随着对基因编辑技术了解逐渐深入,近年... 当前肿瘤疾病依然是威胁人们健康、生活质量的一个重要因素,探寻有效的干预手段来缓解肿瘤疾病发展甚至是治愈肿瘤是临床的重要课题,准确的诊断手段、对病情发展与干预程度的评估是控制病情的前提,随着对基因编辑技术了解逐渐深入,近年来尝试将其应用于治疗肿瘤并取得了一定的成效,其中规律成簇间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白核酸酶9(Regular cluster interval short palindrome repeats/CRISPR-related protein nuclease 9,CRISPR/Cas9)是相对新型的基因编辑手段,通过该技术不但能够准确完成RNA导向,同时还可实现对于DNA的识别、编辑,这种手段让基因编辑技术在高效、安全等方面得到厚实基础,随着该技术的深入已经实现在碱基水平基础上完成定点修饰基因的操作,为该基因编辑技术治疗肿瘤提供可靠的科学依据。CRISPR/Cas9基因编辑技术近年来被应用于治疗肿瘤,该文就对该技术的分子机制以及对于肿瘤疾病的治疗研究相关进展情况作出综述,为以后临床应用该技术治疗肿瘤疾病提供可参考数据。 展开更多

关键词 CRISPR/cas9基因编辑技术 肿瘤 基因治疗 研究进展

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应用基因编辑技术探索建立中枢神经系统动静脉畸形小鼠模型 被引量：2

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作者 徐宏治 徐铭 +3 位作者 陈峻叡 秦智勇 林小凤 陈衔城 《中国临床神经科学》 2016年第2期194-198,共5页

目的采用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠Alk1基因,探讨条件性敲除Alk1建立中枢神经系统动静脉畸形动物模型的可行性。方法利用CRISPR/Cas9技术在小鼠Alk1基因的特定位点插入两个Lox P序列;经传代并与SM22-Cre小鼠交配后培育出Alk1^(2Lox P/2Lo... 目的采用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠Alk1基因,探讨条件性敲除Alk1建立中枢神经系统动静脉畸形动物模型的可行性。方法利用CRISPR/Cas9技术在小鼠Alk1基因的特定位点插入两个Lox P序列;经传代并与SM22-Cre小鼠交配后培育出Alk1^(2Lox P/2Lox P)/Cre目标小鼠。该目标小鼠8周龄时通过他莫昔芬腹腔注射激活Cre重组酶的表达,从而条件性敲除Alk1基因诱导脑动静脉畸形的生成。2周后取小鼠脑组织标本,进行苏木精-伊红染色和病理分析。结果 7只目标小鼠中,2只脑组织病理切片发现管腔大小不一的异常血管病灶。结论条件性敲除Alk1基因可初步建立中枢神经系统动静脉畸形动物模型。 展开更多

关键词 CRISPR/cas9基因编辑技术 Alk1 脑动静脉畸形 模型 小鼠

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