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聚酮合酶大蛋白的表达和纯化方法的建立
1
作者
王川
吴昊
+5 位作者
张灿
汪小杰
刘建军
梁晶丹
李利明
汪志军
《基因组学与应用生物学》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第10期4581-4589,共9页
CalA3是钙霉素生物合成途径中的大型聚酮合酶,生物信息学分析表明CalA3隶属I型聚酮合酶(PKS-I)。本研究通过构建、体外表达,建立了CalA3的纯化流程,获得了高纯度、稳定的巨大蛋白。通过无缝克隆方法,从柯斯质粒p16F9上扩增calA3基因片...
CalA3是钙霉素生物合成途径中的大型聚酮合酶,生物信息学分析表明CalA3隶属I型聚酮合酶(PKS-I)。本研究通过构建、体外表达,建立了CalA3的纯化流程,获得了高纯度、稳定的巨大蛋白。通过无缝克隆方法,从柯斯质粒p16F9上扩增calA3基因片段,C端引入6His Tag,成功构建到表达质粒pET-28a(+)上,得到结果质粒pET-CalA3cH;通过探索不同的表达宿主、共表达分子伴侣和培养基的优化,获得最佳表达条件:在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中通过LBBS培养基与pGro7共表达,获得了该蛋白的最优可溶性高表达;通过Ni2+亲和层析、Heparin、离子交换和凝胶过滤层析多步纯化手段,对CalA3进行了有效分离纯化,获得了高纯度和稳定的蛋白;通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析法测定了CalA3的表观分子量,并推测该蛋白为二聚体;凝胶迁移实验证明CalA3具有DNA结合能力。本研究探索了体外表达和纯化大型聚酮合酶CalA3蛋白的方法,成功获得了大蛋白在大肠杆菌中的异源表达和纯化,表征了CalA3的二聚体分子量为360 kD,并初步确定了CalA3具有体外结合DNA的能力,暗示其在钙霉素生物合成中具有转录调控功能。本研究为进一步研究CalA3的功能提供了理论依据。
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关键词
钙霉素
Ⅰ型聚酮合酶
cala
3
DNA
结合蛋白
原文传递
钙霉素聚酮链释放亚基蛋白性质优化及底物选择性
被引量：
1
2
作者
李希希
王嘉良
+4 位作者
曹卫
李丹丹
邓子新
汪志军
梁晶丹
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第1期194-205,共12页
【目的】钙霉素合成酶亚基CalA3释放钙霉素合成过程中的聚酮链。获得生物化学性质稳定、蛋白结构性质均一的CalA3蛋白,可用于冷冻电镜(cryo-electron microscopy)结构解析,以帮助理解装配线型聚酮合酶亚基释放聚酮链的生物化学机理。探...
【目的】钙霉素合成酶亚基CalA3释放钙霉素合成过程中的聚酮链。获得生物化学性质稳定、蛋白结构性质均一的CalA3蛋白,可用于冷冻电镜(cryo-electron microscopy)结构解析,以帮助理解装配线型聚酮合酶亚基释放聚酮链的生物化学机理。探究CalA3对不同关键结构特征的聚酮链底物的选择性,可为制备CalA3与小分子化合物的复合物提供生化材料,同时也为进一步挖掘CalA3的成酰胺键的应用潜能提供借鉴。【方法】优化CalA3蛋白异源表达菌株的培养条件、CalA3蛋白纯化的生化条件,利用负染电镜观察蛋白形态,计算并分析蛋白质结构的性质;测定CalA3对不同结构的直链聚酮类似物的体外催化活性,利用色谱和质谱分析鉴定CalA3催化N-乙酰半胱氨酸-吡咯-2-丙酸(SNAC-C3)、N-乙酰半胱氨酸-戊酸(SNAC-C5)和月桂酰辅酶A等多种不同结构的直链聚酮底物类似物与3-羟基邻氨基苯甲酸(3-hydroxy anthranilic acid,3HA)反应的产物。【结果】利用优化后的培养基PGTY,不仅实现了高纯度巨型聚酮合酶CalA3超量异源表达,同时,负染电镜观察、计算分析表明蛋白颗粒的结构性质优异。使用该条件纯化获得的CalA3蛋白,可以用于制备冷冻电镜样品,进行结构解析。CalA3催化SNAC-C3、SNAC-C5与3HA发生氨解反应,未检测到CalA3对月桂酰辅酶A底物的催化活性。【结论】蛋白纯化和负染电镜结果显示,本研究成功建立了CalA3异源表达的大肠杆菌培养条件、蛋白纯化生化条件。体外催化实验结果表明CalA3对聚酮链底物的结构选择具有宽泛性。这些发现为进一步探究聚酮合酶的结构、功能及应用提供了一定的借鉴。
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关键词
聚酮合酶
培养基
钙霉素合成酶
cala
3
冷冻电镜
底物特异性
体外催化
聚酮类似物
结构鉴定
原文传递
题名
聚酮合酶大蛋白的表达和纯化方法的建立
1
作者
王川
吴昊
张灿
汪小杰
刘建军
梁晶丹
李利明
汪志军
机构
上海交通大学生命科学技术学院
北京四海华辰科技有限公司
出处
《基因组学与应用生物学》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第10期4581-4589,共9页
基金
973项目(No.2015CB554203)
国家自然基金项目(31470830,21661140002,91753123)共同资助。
文摘
CalA3是钙霉素生物合成途径中的大型聚酮合酶,生物信息学分析表明CalA3隶属I型聚酮合酶(PKS-I)。本研究通过构建、体外表达,建立了CalA3的纯化流程,获得了高纯度、稳定的巨大蛋白。通过无缝克隆方法,从柯斯质粒p16F9上扩增calA3基因片段,C端引入6His Tag,成功构建到表达质粒pET-28a(+)上,得到结果质粒pET-CalA3cH;通过探索不同的表达宿主、共表达分子伴侣和培养基的优化,获得最佳表达条件:在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中通过LBBS培养基与pGro7共表达,获得了该蛋白的最优可溶性高表达;通过Ni2+亲和层析、Heparin、离子交换和凝胶过滤层析多步纯化手段,对CalA3进行了有效分离纯化,获得了高纯度和稳定的蛋白;通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析法测定了CalA3的表观分子量,并推测该蛋白为二聚体;凝胶迁移实验证明CalA3具有DNA结合能力。本研究探索了体外表达和纯化大型聚酮合酶CalA3蛋白的方法,成功获得了大蛋白在大肠杆菌中的异源表达和纯化,表征了CalA3的二聚体分子量为360 kD,并初步确定了CalA3具有体外结合DNA的能力,暗示其在钙霉素生物合成中具有转录调控功能。本研究为进一步研究CalA3的功能提供了理论依据。
关键词
钙霉素
Ⅰ型聚酮合酶
cala
3
DNA
结合蛋白
Keywords
Calcimycin
TypeⅠPKS
cala
3
DNA binding protein
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
钙霉素聚酮链释放亚基蛋白性质优化及底物选择性
被引量：
1
2
作者
李希希
王嘉良
曹卫
李丹丹
邓子新
汪志军
梁晶丹
机构
微生物代谢国家重点实验室、代谢与发育科学国际联合实验室、生命科学技术学院上海交通大学
出处
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第1期194-205,共12页
基金
国家重点研发计划(2019YFA0905404,2021YFA0910501)。
文摘
【目的】钙霉素合成酶亚基CalA3释放钙霉素合成过程中的聚酮链。获得生物化学性质稳定、蛋白结构性质均一的CalA3蛋白,可用于冷冻电镜(cryo-electron microscopy)结构解析,以帮助理解装配线型聚酮合酶亚基释放聚酮链的生物化学机理。探究CalA3对不同关键结构特征的聚酮链底物的选择性,可为制备CalA3与小分子化合物的复合物提供生化材料,同时也为进一步挖掘CalA3的成酰胺键的应用潜能提供借鉴。【方法】优化CalA3蛋白异源表达菌株的培养条件、CalA3蛋白纯化的生化条件,利用负染电镜观察蛋白形态,计算并分析蛋白质结构的性质;测定CalA3对不同结构的直链聚酮类似物的体外催化活性,利用色谱和质谱分析鉴定CalA3催化N-乙酰半胱氨酸-吡咯-2-丙酸(SNAC-C3)、N-乙酰半胱氨酸-戊酸(SNAC-C5)和月桂酰辅酶A等多种不同结构的直链聚酮底物类似物与3-羟基邻氨基苯甲酸(3-hydroxy anthranilic acid,3HA)反应的产物。【结果】利用优化后的培养基PGTY,不仅实现了高纯度巨型聚酮合酶CalA3超量异源表达,同时,负染电镜观察、计算分析表明蛋白颗粒的结构性质优异。使用该条件纯化获得的CalA3蛋白,可以用于制备冷冻电镜样品,进行结构解析。CalA3催化SNAC-C3、SNAC-C5与3HA发生氨解反应,未检测到CalA3对月桂酰辅酶A底物的催化活性。【结论】蛋白纯化和负染电镜结果显示,本研究成功建立了CalA3异源表达的大肠杆菌培养条件、蛋白纯化生化条件。体外催化实验结果表明CalA3对聚酮链底物的结构选择具有宽泛性。这些发现为进一步探究聚酮合酶的结构、功能及应用提供了一定的借鉴。
关键词
聚酮合酶
培养基
钙霉素合成酶
cala
3
冷冻电镜
底物特异性
体外催化
聚酮类似物
结构鉴定
Keywords
polyketide synthase
culture medium
calcimycin synthase
cala
3
cryo-electron microscopy
substrate specificity
in vitro catalysis
polyketide analogues
structure identification
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
聚酮合酶大蛋白的表达和纯化方法的建立
王川
吴昊
张灿
汪小杰
刘建军
梁晶丹
李利明
汪志军
《基因组学与应用生物学》
CAS
CSCD
北大核心
2020
0
原文传递
2
钙霉素聚酮链释放亚基蛋白性质优化及底物选择性
李希希
王嘉良
曹卫
李丹丹
邓子新
汪志军
梁晶丹
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023
1
原文传递
已选择
0
条
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引证文献
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