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流式细胞术检测体外微核方法的建立 被引量:13
1
作者 欧红梅 周长慧 +2 位作者 涂宏刚 黄鹏程 常艳 《癌变.畸变.突变》 CAS CSCD 2015年第1期39-43,共5页
目的:建立96孔板流式细胞术体外微核自动化检测的方法,并探讨其用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的可能性。方法:试验分为+S9短时处理组(4 h)和-S9持续处理组(24 h),分别选择3个不同浓度的环磷酰胺和丝裂霉素C处理CHO-K1细胞,24 ... 目的:建立96孔板流式细胞术体外微核自动化检测的方法,并探讨其用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的可能性。方法:试验分为+S9短时处理组(4 h)和-S9持续处理组(24 h),分别选择3个不同浓度的环磷酰胺和丝裂霉素C处理CHO-K1细胞,24 h后收获细胞。采用EMA和SYTOX Green双色标记,流式细胞仪分析96孔板的微核率,并与常规标准平皿培养、细胞分裂阻滞法的双核微核结果进行比较。结果:在有或无S9处理条件下,不同浓度的环磷酰胺、丝裂霉素C诱导产生的微核率较溶剂对照组均显著增加(P均<0.05),剂量-效应关系明显。两种微核检测方法的Spearman相关系数(r s)为1.000。结论:流式细胞术检测环磷酰胺、丝裂霉素C作用于CHO-K1细胞的微核试验结果均为阳性,与文献报道一致,因而本试验初步建立了流式细胞术体外微核检测方法。流式细胞术检测微核的方法与人工阅片的方法相关性好,提示该方法用于化合物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价具有良好的前景。 展开更多
关键词 cho-k1细胞 体外微核试验 流式细胞术 96孔板
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猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因真核表达载体的构建及表达 被引量:4
2
作者 任雪枫 胡志华 +6 位作者 谈国蕾 周斌 徐学清 郑其升 张晓勇 陈德胜 陈溥言 《中国病毒学》 CSCD 2004年第6期636-638,共3页
Using a pair of specific primers designed according to the relevant nucleotide sequences from GenBank, the main antigen domain for VP2 gene of Porcine parvovirus was ampilified with PCR method using the genomic DNA as... Using a pair of specific primers designed according to the relevant nucleotide sequences from GenBank, the main antigen domain for VP2 gene of Porcine parvovirus was ampilified with PCR method using the genomic DNA as template. The PCR product was cloned into the expression vector pIREShyg to get a recombinant eukaryotic expression plasmid pIREShyg-VP2, which was then transfected into the CHO-K1 cells. The expressed product was detected by IFA after the positive cell clone was selected with hygromycin. The result revealed that the main antigen domain for VP2 gene of porcine parvovirus was stably expressed in CHO-K1 cells. 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2蛋白 潮霉素 cho-k1细胞
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市政污泥及其热处理渣对CHO-K1细胞的毒性研究
3
作者 顾迪 张晨 +3 位作者 顾卫华 赵静 白建峰 张承龙 《有色金属(冶炼部分)》 CAS 北大核心 2024年第8期166-174,共9页
评估市政污泥资源化产物的健康风险对其安全规范利用具有指导意义。分别对某污水处理厂的污泥进行了热解和好氧发酵处理,运用中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)对市政污泥及其热处理渣开展细胞毒性试验和遗传毒性试验,评估其对典型哺乳动物细胞... 评估市政污泥资源化产物的健康风险对其安全规范利用具有指导意义。分别对某污水处理厂的污泥进行了热解和好氧发酵处理,运用中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)对市政污泥及其热处理渣开展细胞毒性试验和遗传毒性试验,评估其对典型哺乳动物细胞的危害和潜在风险。结果显示,与原污泥样品相比,污泥热解渣和好氧发酵渣的细胞毒性和遗传毒性均降低。与原污泥样品相比,RTCA细胞增殖试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣对CHO-K1细胞的生长抑制性明显减弱;CCK-8细胞毒性试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣的细胞相对存活率分别增加了161%和137%;Caspase 3细胞凋亡蛋白酶活力试验结果显示,暴露于污泥热解渣和好氧发酵渣中的CHO-K1细胞的Caspase 3凋亡蛋白酶的活性分别降低了29.3%和20.1%;彗星试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣的尾长分别缩短了64.5%和25.9%,尾矩分别减少了78.4%和28.1%。研究结果表明,热处理技术(热解处理和好氧发酵处理)可减少市政污泥的细胞毒性和遗传毒性,降低市政污泥对生态环境和人体健康的潜在风险。 展开更多
关键词 污泥热处理 cho-k1细胞 细胞毒性 彗星试验 重金属
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无血清悬浮驯化CHO-K1单克隆细胞株的建立及其表达验证
4
作者 谢涛 孙青 +6 位作者 彭秀娥 张朝 张宽 王翠 刘伯宁 李文宾 姚兵 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第8期945-951,共7页
目的通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞,筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株,并进行表达验证。方法采用逐步降低血清含量的方法,将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞;通过单细胞接种/成像系统Verifi... 目的通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞,筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株,并进行表达验证。方法采用逐步降低血清含量的方法,将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞;通过单细胞接种/成像系统Verified In-Situ Plate Seeding(简称VIPS系统)筛选单克隆,经连续培养综合评估单克隆细胞的倍增时间、结团率、细胞直径等参数,确定候选克隆;将候选克隆分别转染携带绿色及红色荧光蛋白的质粒,根据荧光蛋白表达情况确定1株克隆作为工程细胞株的宿主细胞。结果驯化获得的CHO-K1细胞适应无血清悬浮培养,倍增时间为20~24 h;通过单克隆筛选和产量评估确定的单克隆细胞株单克隆源性良好且可追溯,以0.5×10~6个/mL的细胞密度接种,培养7 d最高细胞密度可达8.27×10~6个/mL,活率不低于80%,平均倍增时间20.31 h,能较好地表达外源基因。结论通过无血清驯化培养,成功获得单克隆源性可追溯、生长状态良好且能够用于蛋白高表达的CHO-K1细胞株。 展开更多
关键词 cho-k1细胞 无血清培养 细胞驯化 单克隆筛选 外源蛋白表达
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流式细胞术检测体外微核方法的验证 被引量:5
5
作者 欧红梅 周长慧 +2 位作者 涂宏刚 徐灵芝 常艳 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第14期1590-1598,共9页
目的:采用不同作用强度、不同作用机制的遗传毒性化合物及非遗传毒性化合物验证已建立的96孔板流式细胞术体外微核自动化检测方法。方法:试验分为+S9短时处理组(4 h)和-S9持续处理组(24 h),加样后24 h(5-氟尿嘧啶为48 h)收获细胞。验证... 目的:采用不同作用强度、不同作用机制的遗传毒性化合物及非遗传毒性化合物验证已建立的96孔板流式细胞术体外微核自动化检测方法。方法:试验分为+S9短时处理组(4 h)和-S9持续处理组(24 h),加样后24 h(5-氟尿嘧啶为48 h)收获细胞。验证的化合物分别选择3个不同浓度处理CHO-K1细胞,设置环磷酰胺(+S9组)或丝裂霉素C(-S9组)的阳性对照和溶剂对照。采用EMA和SYTOX green双色标记,流式细胞仪分析96孔板的微核率,并与常规平皿培养、人工阅片的细胞分裂阻滞法的双核微核结果进行比较。结果:人工阅片和流式细胞术检测验证化合物诱导CHO-K1细胞微核的结果一致。在有或无S9处理条件下,甲基磺酸甲酯、秋水仙素、依托泊苷和4-硝基喹啉-1-氧化物体外微核试验结果均为阳性;5-氟尿嘧啶和己烯雌酚仅在无代谢活化系统条件下,试验结果为阳性;苯并芘仅在代谢活化系统的情况下,试验结果为阳性;氯化钠、蔗糖和2-氨基蒽体外微核试验结果为阴性。结论:本试验进一步证实流式体外微核检测方法灵敏度高、特异性好,可代替人工阅片的双核微核方法,用于化合物遗传毒性早期筛选和遗传毒性评价。 展开更多
关键词 cho-k1细胞 体外微核试验 流式细胞仪 人工阅片 方法验证
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CHO细胞表达重组人生长激素-Fc融合蛋白糖基化类型的优化
6
作者 张凯宁 刘涵 +6 位作者 朱秋媚 富锐丽 刘玉林 孙瑞欣 刘景会 赵竞男 韩雪容 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期200-206,共7页
目的优化CHO细胞表达重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白,以获得更优的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。方法在7 L生物反应器中培养表达rhGH-Fc的CHO细胞,通过改善补料培养基成分(使用3种商业化... 目的优化CHO细胞表达重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白,以获得更优的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。方法在7 L生物反应器中培养表达rhGH-Fc的CHO细胞,通过改善补料培养基成分(使用3种商业化培养基:Gly-1:EX-CELL Glycosylation Adjust、Gly-2:SHEFF-CHO PLUS PG ACF、Gly-3:EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed),对rhGH-Fc糖基化修饰进行调整,并通过质谱分析目的蛋白的糖基化类型及比例。结果Gly-1、Gly-2、Gly-3的G0F(主要糖型一般为G0、G1和G2,F为岩藻糖)分别为32.89%、58.66%、33.28%,G1F分别为31.39%、18.03%、34.90%,G2F分别为31.39%、18.03%、34.90%,Gly-1与Gly-3使目的蛋白含有更少的G0F及更多的G2F;Gly-3补料方案在高甘露糖修饰方面较其他两种方案更少。结论Gly-1培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,Gly-2培养基使糖基化修饰从G2F、G1F向G0F转变,Gly-3培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,且高甘露糖含量在5%以下。Gly-3培养基可能具有更好的修改目的蛋白糖基化类型及比例的效果。 展开更多
关键词 重组人生长激素-Fc融合蛋白 cho-k1细胞 糖基化修饰
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淀粉微载体的制备及对CHO-K1细胞培养的初步应用 被引量:4
7
作者 张磊 李明生 +4 位作者 郑荣 张健 靳冬武 马忠仁 冯玉萍 《天然产物研究与开发》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期454-460,516,共8页
以普通市售马铃薯淀粉为原材料,在常温下利用W/O乳化方法制备了交联淀粉微球,并以二乙胺基乙基修饰了微球的表面电荷。同时研究了制备淀粉微球的制备工艺和改性工艺,成功制备了适合细胞培养用的淀粉微载体。利用扫描电镜(SEM)、红外(FT-... 以普通市售马铃薯淀粉为原材料,在常温下利用W/O乳化方法制备了交联淀粉微球,并以二乙胺基乙基修饰了微球的表面电荷。同时研究了制备淀粉微球的制备工艺和改性工艺,成功制备了适合细胞培养用的淀粉微载体。利用扫描电镜(SEM)、红外(FT-IR)、X射线衍射仪(XRD)对微球进行了表征。结果表明,最佳制备条件为:淀粉溶液浓度为7%,搅拌速度为500 rpm,交联剂用量为8%,水油相体积比1∶6;微球表面修饰最佳条件为:加入微球质量2倍体积的3.5 mol/L NaOH溶液和2.5 mol/L DEAE-HCl溶液,60℃密闭反应4 h。对比Cytodex-1微载体,培养CHO-K1细胞至144 h时,淀粉微载体表面细胞密度达到1.8×10~6cells/mL,且两者培养效果相似,表明了自制淀粉微载体是一种潜在的贴壁细胞培养用高分子材料。 展开更多
关键词 马铃薯淀粉 淀粉微球 二乙氨基乙基 cho-k1细胞 细胞培养
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生物反应器培养CHO细胞的生长与代谢研究
8
作者 孙明波 李卫东 +4 位作者 吴炳元 余华 衡燮 廖国阳 姜述德 《云南大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 2002年第5期388-392,共5页
在搅拌式生物反应器中 ,应用批培养、流加培养和灌流培养 3种方法对CHO -k1细胞进行了培养 .3种方法最大活细胞密度分别达到了 2 .0× 10 6,2 .7× 10 6和 9.6× 10 6mL-1.对培养过程中葡萄糖和氨基酸及代谢产物氨和乳酸的... 在搅拌式生物反应器中 ,应用批培养、流加培养和灌流培养 3种方法对CHO -k1细胞进行了培养 .3种方法最大活细胞密度分别达到了 2 .0× 10 6,2 .7× 10 6和 9.6× 10 6mL-1.对培养过程中葡萄糖和氨基酸及代谢产物氨和乳酸的动态变化进行了检测和分析 .结果表明 ,CHO细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的摄取以及氨和乳酸的产生与培养液中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度正相关 ,培养过程中控制葡萄糖和谷氨酰胺的加入量能够明显降低氨和乳酸的产生 ,提高代谢效率 。 展开更多
关键词 cho-k1细胞 生物反应器 细胞生长 细胞培养 细胞代谢 生物工程
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^(60)Co γ-射线辐照新生牛血清对细胞培养的影响 被引量:2
9
作者 乔自林 马桂兰 +4 位作者 王家敏 李明生 冯若飞 令世鑫 马忠仁 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第5期481-484,共4页
目的研究新生牛血清(newborn calf serum,NBCS)经^(60)Coγ-射线辐照后对细胞培养的影响。方法用20 k Gy^(60)Coγ-射线辐照NBCS后,培养Vero和CHO-K1细胞,通过连续传代培养及绘制低密度生长曲线,比较辐照前后的促细胞生长效果。结果 Ver... 目的研究新生牛血清(newborn calf serum,NBCS)经^(60)Coγ-射线辐照后对细胞培养的影响。方法用20 k Gy^(60)Coγ-射线辐照NBCS后,培养Vero和CHO-K1细胞,通过连续传代培养及绘制低密度生长曲线,比较辐照前后的促细胞生长效果。结果 Vero细胞的传代培养结果与未辐照前接近,生长曲线峰值略低于未辐照组,辐照前后细胞的最大增殖密度为73.38×10~4和65.33×10~4个/ml(P>0.05),倍增时间为24.38和25.33 h(P>0.05);CHOK1细胞传代培养无未辐照组致密,生长曲线较未辐照组平缓,辐照前后细胞的最大增殖密度为80.03×10~4和79.3×10~4个/ml(P>0.05),倍增时间为19.73和23.62 h(P<0.05)。结论 NBCS经20 k Gy ^(60)Coγ-射线辐照后,对Vero细胞影响不明显,使CHO-K1细胞生长速度变慢。 展开更多
关键词 牛血清 γ-射线 细胞培养 VERO细胞 cho-k1细胞
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白细胞介素-7基因慢病毒表达载体的构建及在CHO-K1细胞中的稳定表达 被引量:2
10
作者 李向茸 令瑛 +5 位作者 徐雷 包晓婧 马玉梅 车敏娜 张海霞 冯若飞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第6期571-576,共6页
目的构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上... 目的构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上,构建重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7,在HEK293T细胞中进行病毒包装,检测病毒滴度后,收获细胞毒液,感染CHO-K1细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达IL-7的CHO-K1-r IL-7细胞。荧光显微镜观察感染细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测IL-7基因m RNA的转录;ELISA法检测IL-7的含量;Western blot法检测IL-7的表达。结果重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7经双酶切及测序结果证明构建正确。慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。慢病毒感染CHO-K1细胞24、48和72 h后,均可见特异性绿色荧光蛋白表达,且随着培养时间的延长,荧光强度明显增强;CHO-K1-r IL-7细胞可扩增出约540 bp的IL-7基因片段;经ELISA检测,样品中IL-7含量为0.6 ng/ml;表达产物主要存在于CHO-K1-r IL-7细胞上清中,且具有良好的反应原性。结论成功构建了IL-7基因慢病毒重组表达质粒,并实现了IL-7在CHO-K1细胞上的稳定表达。 展开更多
关键词 白细胞介素-7 慢病毒 cho-k1细胞 稳定表达
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以组织因子为靶点的肿瘤免疫治疗结合物的合成及其对结直肠癌细胞的影响 被引量:2
11
作者 许希 饶本强 +4 位作者 梁绮雯 刘丹 谭获 汪建平 黄振倩 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期420-426,共7页
目的:构建含hFⅦ-LC+hIgG1-Fc cDNA的重组真核表达载体,并转染中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1获得以组织因子(TF)为靶点的免疫治疗结合物用于肿瘤的靶向治疗。方法:用分子生物学方法从汉族人肝组织和淋巴细胞中分别获得hFⅦ-LC和hIgG1-Fc ... 目的:构建含hFⅦ-LC+hIgG1-Fc cDNA的重组真核表达载体,并转染中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1获得以组织因子(TF)为靶点的免疫治疗结合物用于肿瘤的靶向治疗。方法:用分子生物学方法从汉族人肝组织和淋巴细胞中分别获得hFⅦ-LC和hIgG1-Fc DNA片段并用连接酶正向克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中。以脂质体法转染阳性质粒入CHO-K1细胞,G418加压筛选获得阳性单克隆细胞;Excel 301无血清培养液扩大培养,培养液Ni-NTA亲和层析纯化和制备hFⅧ-LC+hIgG1-Fc融合蛋白,ELISA法检测该融合蛋白与TF的靶向作用,免疫激活物与结肠癌细胞HT-29及NK细胞混合培养检测结合物激活NK细胞的能力。结果:以汉族人肝组织和淋巴细胞为模板扩增的hFⅦ-LC和hIgG1-Fc DNA片段经测序证实与基因库报道的系列完全一致;经酶切分析、测序证实构建的hFⅦ-LC+hIgG1-Fc融合基因片段完整地落在真核表达质粒pcDNA3.1(+)的阅读框架中;Lipofectamine^(TM)2000转染试剂能获得含pcDNA3.1(+)-hFⅦ-LC+hIgG1-Fc阳性的CHO-K1细胞,经1g/L G418加压筛选可以获得分泌hFⅦ-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的单克隆细胞株;ILExcel301无血清培养液用Ni-NTA亲和层析纯化可以制备1.3 mg hFⅦ-LC+hIgG1-Fc融合蛋白,经ELISA法鉴定与TF具有高亲和力,免疫激活物与结肠癌细胞HT-29及NK细胞混合培养表现出明显的激活NK细胞的能力。结论:成功构建了hFⅦ-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的真核表达载体并获得了分泌hFⅦ-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的CHO-K1单克隆细胞株,为制备以TF为靶点的肿瘤免疫治疗结合物奠定了基础。 展开更多
关键词 肿瘤靶向治疗 组织因子 免疫结合物 cho-k1细胞
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长效重组人生长激素纯化液中CHO-K1细胞残留DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证 被引量:2
12
作者 刘莹 刘玉林 +5 位作者 俞露 刘涵 刘云南 王莹 刘琳琳 王宇 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第6期688-693,共6页
目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以... 目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以其为标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法;并对方法进行灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性及耐用性验证。结果建立的方法灵敏度可达2. 6×10~1 copies/μL。标准曲线的回归方程为y=-3. 487 x+30. 201,R^2=0. 999;检测样品中DNA回收率在73. 56%~101. 87%范围内,RSD均小于10%;该方法可特异性扩增CHO-K1细胞的基因组DNA,而Vero细胞、MDCK细胞、Wish细胞及大肠埃希菌等基因组DNA均未见明显的扩增;样品精密度测定Ct的RSD在0. 4%~2. 95%之间;于两种不同PCR仪器上检测标准品,扩增效率分别为98%、99%,相关系数R^2均为0. 999。结论成功建立了一种检测CHO-K1细胞表达Fc-rhGH纯化液的残留DNA的实时荧光定量PCR方法,该方法具有较好的灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性和耐用性。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR 重组人生长激素 cho-k1细胞 残留DNA
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重组人VEGF可溶性受体的表达纯化及结合性质初探 被引量:2
13
作者 李伊培 高丽华 +7 位作者 张连成 邵勇 刘羽 潘芸 高招刚 张嵘 胡显文 陈惠鹏 《生物技术通讯》 CAS 2014年第2期165-169,共5页
目的:表达优化的血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1(VEGFR1)胞外区第2个类免疫球蛋白结构域(VEGFR1D2)和VEGF受体2(VEGFR2)胞外区第3个类免疫球蛋白结构域(VEGFR2D3)与人IgG1 Fc片段的融合产物VEGF-Trap2,探讨该产物与人源VEGF165(hVEGF1... 目的:表达优化的血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1(VEGFR1)胞外区第2个类免疫球蛋白结构域(VEGFR1D2)和VEGF受体2(VEGFR2)胞外区第3个类免疫球蛋白结构域(VEGFR2D3)与人IgG1 Fc片段的融合产物VEGF-Trap2,探讨该产物与人源VEGF165(hVEGF165)之间的亲和力。方法:将优化的目的基因VEGFR1D2/R2D3连接到真核表达载体pIRES2-EGFP-Fc中,转染CHO-K1细胞并筛选高表达目的蛋白VEGF-Trap2的细胞系,亲和纯化VEGF-Trap2蛋白,通过非竞争性ELISA及生物膜干涉技术检测VEGF-Trap2与hVEGF165之间的亲和力。结果:DNA测序表明真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2序列正确;获得表达VEGF-Trap2的细胞系;非竞争性ELISA实验中,VEGF-Trap2与hVEGF165功能性亲和常数达到1.86×107L/mol;生物膜干涉实验中,hVEGF165与VEGF-Trap2的平衡解离常数达到3.13×10-9mol/L。结论:构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2并在CHO-K1细胞中稳定表达,重组蛋白VEGF-Trap2与hVEGF165有较高的亲和力,提示其可用于阻断VEGF信号传导途径,为该蛋白进一步的体外及体内实验奠定了基础。 展开更多
关键词 血管内皮细胞生长因子受体 VEGF-Trap FC融合蛋白 cho-k1细胞 抗肿瘤
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CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素毒性的优化及验证 被引量:2
14
作者 曹方 刘海昌 +5 位作者 王磊 马伟 潘玲玲 李强 王良超 胡文龙 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第12期1344-1346,共3页
目的对CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)毒性进行优化及验证。方法以国家PT标准品为参考品,将PT标准品倍比稀释后与CHO-K1细胞混合培养,显微镜观察PT能引起CHO-K1细胞簇集的程度。对细胞浓度、孵育时间进行优化,并... 目的对CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)毒性进行优化及验证。方法以国家PT标准品为参考品,将PT标准品倍比稀释后与CHO-K1细胞混合培养,显微镜观察PT能引起CHO-K1细胞簇集的程度。对细胞浓度、孵育时间进行优化,并对方法的特异性、敏感度、重复性进行验证。结果方法的最佳细胞浓度为2.5×105个/ml,最佳孵育时间为24 h。只有PT活性成分能使CHO-K1细胞发生簇集,最低检测限为10 pg/ml;2名试验员6次检测结果表明,该方法重复性良好。结论 CHO-K1细胞簇集法可及时、准确地检测出生产过程中PT含量,适用于百日咳发酵过程监测。 展开更多
关键词 cho-k1细胞 百日咳毒素 簇集
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人白血病抑制因子真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达 被引量:1
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作者 马涛 肖雪 +2 位作者 吕琦 王泽华 马岚 《云南大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第S1期387-392,395,共7页
应用RT-PCR方法从人子宫内膜组织总RNA扩增出hLIF的全长基因,然后将其克隆至pcDNA3上,成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/hLIF.利用脂质体介导将这一表达载体导入COS-7细胞和CHO-K1细胞,分别获得了hLIF的瞬时表达和稳定表达,为进一步进... 应用RT-PCR方法从人子宫内膜组织总RNA扩增出hLIF的全长基因,然后将其克隆至pcDNA3上,成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/hLIF.利用脂质体介导将这一表达载体导入COS-7细胞和CHO-K1细胞,分别获得了hLIF的瞬时表达和稳定表达,为进一步进行hLIF生物学功能研究和hLIF在哺乳动物细胞中的高表达研究奠定了基础. 展开更多
关键词 人白血病抑制因子 COS-7细胞 cho-k1细胞 克隆 基因表达
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重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞染色体核型分析 被引量:1
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作者 张宇 俞露 +6 位作者 郑全莉 刘涵 刘云南 刘玉林 郭胜苍 许佳慧 王宇 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第3期286-288,共3页
目的分析重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用... 目的分析重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用手动测量工具(manual measurements)随机测量50个2n=22的CHO-k1和rhGH-CHO细胞中染色体长臂和短臂长度,计算各染色体的相对长度(各染色体与最长染色体长度的比值)及短臂/长臂的比值,并绘制染色体核型的B-Spline特征曲线。结果 rhGH-CHO和CHO-k1细胞的染色体数目均为22条,且染色体核型特征曲线一致。结论 rhGH-CHO细胞来源于CHO-k1细胞,且未受其他细胞污染。 展开更多
关键词 重组人生长激素 FC融合蛋白 cho-k1细胞 染色体 核型分析
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人AChR-Fc融合蛋白真核表达载体的构建和表达 被引量:1
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作者 常婷 林宏 +1 位作者 刘煜 李柱一 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 CAS 2011年第4期276-279,共4页
目的构建含人AChRα1亚单位胞外段(Hα1-210)-IgG1Fc融合基因的真核表达载体,表达人AChR-Fc融合蛋白。方法扩增Hα1-210基因,插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组... 目的构建含人AChRα1亚单位胞外段(Hα1-210)-IgG1Fc融合基因的真核表达载体,表达人AChR-Fc融合蛋白。方法扩增Hα1-210基因,插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组表达载体pAN-Hα1-210,并经酶切、测序鉴定;采用脂质体法将重组载体转染CHO-K1细胞,经G418加压筛选、ELISA检测,挑选高表达融合蛋白的阳性转化子扩大培养;表达的AChR-Fc融合蛋白经Protein A亲和层析柱纯化,SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果酶切及测序结果证实Hα1-210基因序列正确,真核表达载体pAN-Hα1-210构建成功;ELISA检测证实AChR-Fc融合蛋白在细胞培养上清中呈分泌表达;SDS-PAGE结果显示该融合蛋白的相对分子质量约为51 000;Western blot结果显示该融合蛋白能被特异性单克隆抗体mAb198所识别。结论成功构建pAN-Hα1-210真核表达载体,并获得具有生物活性的AChR-Fc融合蛋白,为进一步开展融合蛋白靶向B细胞治疗重症肌无力的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 重症肌无力 融合蛋白 真核表达 chok1细胞
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无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系的建立及其生物学特性 被引量:1
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作者 杨妍梅 冯若飞 +3 位作者 谢晶莹 李向茸 王丹 马忠仁 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第2期180-184,共5页
目的建立无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系,并检测其生物学特性。方法将CHO-K1贴壁细胞通过逐步降低血清浓度,获得低血清CHO-K1贴壁细胞,以3×105个/ml接种于含无血清培养基SFM4CHO的150 ml三角瓶中,摇床无血清适应培养,获得CHO-K1-... 目的建立无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系,并检测其生物学特性。方法将CHO-K1贴壁细胞通过逐步降低血清浓度,获得低血清CHO-K1贴壁细胞,以3×105个/ml接种于含无血清培养基SFM4CHO的150 ml三角瓶中,摇床无血清适应培养,获得CHO-K1-SFS细胞。对该细胞进行生长曲线绘制、微生物污染检测、代谢分析及外源基因表达检测。结果所获得的CHO-K1-SFS细胞系可无血清悬浮培养,以3×105个/ml的初始密度接种,最大增殖浓度可达3.8×106个/ml,平均倍增时间为29.7 h;无细菌、真菌、病毒和支原体污染;对葡萄糖利用率较高,乳酸产生较多;能较好地表达外源基因。结论成功建立了无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系,为建立高效的外源基因表达平台奠定了基础。 展开更多
关键词 cho-k1细胞 无血清培养 悬浮培养 生物学特性
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重组猪单链IL-12的构建及真核表达 被引量:1
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作者 王雪梅 袁远英 +3 位作者 方强 夏惠 孙新 李柏青 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1687-1692,共6页
目的克隆猪IL-12(pIL-12)p35和p40亚单位cDNA,构建含有重组猪单链IL-12(pscIL-12)融合基因的真核表达质粒并进行表达。方法分别从正常成年肉猪的外周血单个核细胞(PBMCs)和脾淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR分别获得pIL-12 p35和p40亚单... 目的克隆猪IL-12(pIL-12)p35和p40亚单位cDNA,构建含有重组猪单链IL-12(pscIL-12)融合基因的真核表达质粒并进行表达。方法分别从正常成年肉猪的外周血单个核细胞(PBMCs)和脾淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR分别获得pIL-12 p35和p40亚单位编码序列的cDNA,应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头(linker)(Gly4Ser)3串联这两个亚基构建融合基因pscIL-12,将融合基因pscIL-12插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过阳离子聚合物介导转染CHO-K1细胞进行表达,RT-PCR鉴定pscIL-12融合基因在真核细胞中的表达。结果所克隆的pIL-12 p35亚基和p40亚基的编码基因序列和构建的融合基因pscIL-12序列均经PCR、酶切、测序得以证实;融合基因pscIL-12在CHO-K1细胞中成功转录。结论成功构建了pcDNA3.1(+)-pscIL-12融合基因的真核表达质粒;pcDNA3.1(+)-pscIL-12在CHO-K1细胞中成功转录,为进一步探讨pscIL-12融合蛋白的生物学活性和疫苗佐剂效应奠定了基础。 展开更多
关键词 白细胞介素-12 单链 分子克隆 真核表达 cho-k1细胞
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猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立 被引量:1
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作者 徐建 霍珊珊 +4 位作者 张建楼 张永红 崔丹 仲飞 李秀锦 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期88-92,122,共6页
猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI... 猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。 展开更多
关键词 猪CD163 稳定表达细胞系 cho-k1细胞 流式细胞术
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