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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力 被引量:12
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作者 张海 师长宏 +3 位作者 薛莹 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期443-446,共4页
目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原... 目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫后,取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后计数脾脏中的细菌数。结果:ESAT6-CFP10融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6400。淋巴细胞刺激增殖指数为1.90±0.15,明显高于生理盐水组(0.90±0.15);IFN-γ和IL-2的含量分别为1.792±19ng/L和0.211±11ng/L,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时融合蛋白诱导的脾细胞杀伤率为36%。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,融和蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为5.24±0.15,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏中细菌负荷减少甚微。结论:ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 疫苗 ESAT6 cfp10 重组融合蛋白
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早期诊断结核性脑膜炎的新方法:检测浓缩脑脊液中CFP-10和ESAT-6 被引量:15
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作者 吴晓牧 刘丽娟 +5 位作者 许志强 胡国柱 曹文锋 黄刚 胡凡 张昆南 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期347-350,共4页
目的:应用酶联免疫吸附试验检测浓缩的脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10(CFP10)和6000早期分泌性抗原靶(ESAT-6),评价其在结核性脑膜炎(TBM)早期诊断中的价值。方法:应用ELISA测定46例临床诊断为TBM和56例非TBM患者脑脊液... 目的:应用酶联免疫吸附试验检测浓缩的脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10(CFP10)和6000早期分泌性抗原靶(ESAT-6),评价其在结核性脑膜炎(TBM)早期诊断中的价值。方法:应用ELISA测定46例临床诊断为TBM和56例非TBM患者脑脊液原液及经透析袋浓缩10倍的脑脊液浓缩液中CFP10和ESAT-6。结果:TBM患者脑脊液原液CFP10检测敏感度为13.04%、特异度为100.00%,ESAT-6的敏感度为13.04%、特异度为100.00%;而浓缩液CFP10的敏感度为78.26%、特异度为96.42%,ESAT-6的敏感度为76.09%、特异度为98.18%。结论:应用反透析方法浓缩脑脊液,使用抗CFP10和ESAT-6 ELISA检测脑脊液CFP10和ESAT-6能显著提高其敏感度,是一种简单、快速早期诊断结核性脑膜炎的有效辅助方法。 展开更多
关键词 结核性脑膜炎 酶联免疫吸附试验 cfp10 ESAT-6
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表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性 被引量:6
3
作者 张海 师长宏 +3 位作者 王丽梅 薛莹 柏银兰 徐志凯 《第四军医大学学报》 北大核心 2007年第6期489-492,共4页
目的:研究表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对结核分枝杆菌(MTB)感染小鼠的保护能力.方法:以100μg重组质粒pcDNA-e6c10接种BALB/c小鼠腓前肌,共免疫3次.末次免疫结束2wk后,检测免疫... 目的:研究表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对结核分枝杆菌(MTB)感染小鼠的保护能力.方法:以100μg重组质粒pcDNA-e6c10接种BALB/c小鼠腓前肌,共免疫3次.末次免疫结束2wk后,检测免疫小鼠特异性抗体滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤效应以及诱导IFN-γ和IL-2水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠以1×105MTB毒株H37Rv经尾静脉进行攻击,4wk后计数脾脏细菌负荷数,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用.结果:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶800.淋巴细胞刺激增殖指数为2.42±0.13,显著高于生理盐水对照组;免疫小鼠诱导IFN-γ含量(2449±12)ng/L与卡介苗(BCG)组无明显差异,IL-2含量(198±16)ng/L不及BCG免疫组,但显著高于生理盐水对照组;同时融合蛋白诱导的CTL杀伤率为42%.与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有较明显抵抗作用(细菌负荷4.51±0.23,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷无明显减少.结论:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗能在结核病预防中有一定免疫治疗作用. 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 疫苗 DNA ESAT6 cfp10 融合蛋白 免疫原性
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牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及其在牛结核病检测中的应用 被引量:8
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作者 徐贤坤 熊毅 +2 位作者 龙剑明 刘棋 曾宪垠 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期796-802,共7页
采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6。重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定... 采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6。重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,获得约42 ku带有6×His蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%。用HIS蛋白纯化柱纯化该蛋白,Western-blot分析显示,该融合蛋白能与抗牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ,其特异性优于结核菌素。结果表明,获得的重组融合蛋白rHIS-CFP10/ESAT6为牛结核病的诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 牛结核病 融合蛋白 cfp-10 ESAT-6
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微滴数字PCR定量检测全血样品中结核分枝杆菌特异CFP10基因 被引量:9
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作者 宋能 谭杨 +4 位作者 罗凤玲 关清 闫明哲 潘勤 章晓联 《中国生化药物杂志》 CAS 2016年第2期10-15,共6页
目的 采用微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,dd PCR)检测全血中结核分枝杆菌特异性CFP10(10-k Da culture filtrate protein,CFP10)基因的拷贝数含量。方法 收集10例活动性肺结核患者(active tuberculosis,a TB)、10例肺外结... 目的 采用微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,dd PCR)检测全血中结核分枝杆菌特异性CFP10(10-k Da culture filtrate protein,CFP10)基因的拷贝数含量。方法 收集10例活动性肺结核患者(active tuberculosis,a TB)、10例肺外结核患者(extrapulmonary tuberculosis,EPTB)和5例健康对照者(healthy donars,HDs)全血并提取DNA,优化引物最佳扩增条件并制定重组质粒标准曲线,对样本中CFP10基因的拷贝数含量分别用dd PCR与实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)进行检测和比较。结果 对重组质粒的灵敏度检测显示dd PCR技术明显优于q PCR技术。对样本的检测显示q PCR技术检测a TB、EPTB患者与健康人的全血中CFP10含量之间无统计学意义;但是dd PCR技术检测a TB、EPTB患者与健康人之间有显著统计学意义(P〈0.0001);dd PCR检测a TB和EPTB患者(共20例)CFP10基因绝对定量的浓度约为3.4~94.0 copies/μL。结论 本研究首次报道采用dd PCR技术能灵敏地用于TB患者全血的诊断。 展开更多
关键词 微滴数字PCR 结核分枝杆菌 定量检测 cfp10
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结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测 被引量:9
6
作者 冯晓燕 Albert W.Tam +4 位作者 陈坤 王国华 宋晓国 朱翠侠 张贺秋 《生物技术通讯》 CAS 2006年第6期865-867,共3页
目的:克隆38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性。方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBV... 目的:克隆38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性。方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBVIL1表达载体,在大肠杆菌HB101株中进行表达,以间接ELISA方法初步评价其抗原性。结果:获得了结核分枝杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所纯化获得的抗原具有良好的抗原性。结论:pBVIL1表达载体可以高效表达多种结核分枝杆菌抗原,38kD、ESAT-6和CFP10抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 抗原 38kD ESAT-6 cfp10 MPT64
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结核杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用 被引量:10
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作者 孟茹 陈创夫 +2 位作者 张辉 乔军 王正荣 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2010年第10期1-4,共4页
针对结核杆菌CFP10基因序列设计并合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测CFP10基因的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法。检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.997,对初始模板... 针对结核杆菌CFP10基因序列设计并合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测CFP10基因的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法。检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.997,对初始模板的检出下限为1×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍。表明建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于结核杆菌CFP10的病原检测及定量分析。 展开更多
关键词 结核杆菌 cfpIO SYBR Green I荧光定量PCR
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四种牛分枝杆菌特异性蛋白融合表达及在牛结核病诊断中的临床应用 被引量:7
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作者 吴波 张书环 +12 位作者 邓铨涛 项杰 陈军 刘朝 陈鑫 宋念华 陶淑珍 黄继根 韩永佩 赵波 林祥梅 陈焕春 郭爱珍 《中国奶牛》 2007年第10期16-20,共5页
以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金... 以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本,结果与ICG的符合率为93.33%(140/150)。以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国荷斯坦奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清,结果iELISA与TST的总符合率为87.32%(489/560)。对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性,iELISA与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。 展开更多
关键词 IELISA 融合蛋白 牛结核病 MPB70 MPB83 cfp10 ESAT-6
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结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38kD-ESAT6-CFP10的构建与抗原性初步检测 被引量:7
9
作者 冯晓燕 陈坤 +5 位作者 宋晓国 王国华 朱翠侠 李惠文 韦攀健 张贺秋 《中国实验诊断学》 北大核心 2009年第3期285-288,共4页
目的为了提高结核病诊断试剂的特异性和敏感性,构建了结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38 kD-ESAT6-CFP10,并且采用双抗原夹心ELISA方法初步分析了该融合抗原的抗原性。方法运用生物学软件分析抗原优势肽段并模拟其串联后的三维结构,... 目的为了提高结核病诊断试剂的特异性和敏感性,构建了结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38 kD-ESAT6-CFP10,并且采用双抗原夹心ELISA方法初步分析了该融合抗原的抗原性。方法运用生物学软件分析抗原优势肽段并模拟其串联后的三维结构,以确保串联后仍保持良好的抗原性。通过PCR方法分别扩增38 kD、ESAT-6和CFP10抗原优势肽段基因并将其进行连接,然后将融合基因分别连接入pBVIL1和pGEX-4T-2表达载体,在大肠杆菌菌株DH5α中进行表达。将两种不同载体表达的38 kD-ESAT6-CFP10融合抗原分别作为包被抗原和标记抗原,以双抗原夹心ELISA方法初步评价其抗原性。结果获得了38 kD、ESAT-6和CFP10的抗原优势肽段融合抗原38 kD-ESAT6-CFP10,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所获得的抗原具有良好的抗原性。结论该种抗原优势肽段融合抗原有望成为结核病血清学诊断的重要候选抗原,并且双抗原夹心ELISA方法有助于提高检测的特异性和敏感性。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 38 KD ESAT-6 cfp10 抗原优势肽段融合抗原
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Th1型细胞因子基因对结核分枝杆菌基因疫苗诱导BALB/c小鼠产生抗CFP10抗体水平的影响 被引量:6
10
作者 范雄林 王丽梅 +5 位作者 王福祥 师长宏 李元 薛莹 柏银兰 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期260-262,共3页
目的 :研究分别表达含IL 12和IL 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)H3 7Rv 株CFP10基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单个核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体 ... 目的 :研究分别表达含IL 12和IL 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)H3 7Rv 株CFP10基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单个核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体 pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1的BamHI和EcoRI酶切位点。将分别表达小鼠IL 12和人IL 18基因的真核表达质粒pcmIL12和pcIL18,与MTBCFP10基因疫苗联合肌注免疫BALB/c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2wk。每次免疫后 2wk采血、分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗CFP10抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBC的RNA中扩增出IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHI和EcoRI酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体 pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。pc CFP10组第 1次免疫后 ,血清抗CFP10抗体的平均滴度为 1∶6 0 0 ,末次免疫后的滴度为 1∶4 0 0 0。pcIL18+pcCFP10组联合免疫后 ,血清抗CFP10抗体的滴度高于 pcCFP10组 ,最终达 1∶80 0 0。而pcmIL12 + pcCFP10组联合免疫后滴度仅为 1∶2 0 0。结论 :pcIL18与CFP10基因疫苗联合免疫 ,可增强CFP10抗原的特异性体液免疫应答 ;pcmIL12则可使CFP10基因疫苗产生的抗体水平降低。pcIL18+ pcCFP10基因联合免疫是否具有? 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 cfp10 基因疫苗 IL—12 IL—18
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基于结核菌素与CFP10/ESAT6的牛IFN-γ检测法在牛结核病诊断中的比较研究 被引量:7
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作者 陈颖钰 邓铨涛 +4 位作者 郭爱珍 晁彦杰 匡有吉 于清龙 陈焕春 《中国奶牛》 2008年第6期12-14,共3页
本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应,探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液... 本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应,探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液,肝素抗凝。每1mL全血与1mLRPMI1640完全培养基混合均匀,并加入0.1mL(20μg)PHA(阳性对照孔)、0.1mL(20μg PHA)CFP10/ESAT6融合蛋白、0.1mL(2000U)牛结核菌素(PPD/B)、0.1mL(2500U)禽结核菌素(PPD/A)或等量PBS(无刺激阴性对照),37℃培养过夜。次日用夹心ELISA法检测各刺激组0.1mL培养上清的IFN-γ,以OD630表示IFN-γ浓度。结果,特异性抗原CFP10/ESAT6刺激组与牛结核菌素(PPD/B)刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性,相关系数为0.84。但CFP10/ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应(以两刺激组IFN-γ浓度差值表示)间无相关性,相关系数为-0.11。分析禽PPD组的IFN-γ反应,发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0.17为阳性反应切割值,牛PPD检出阳性牛21头,CFP10/ESAT6检出20头,牛和禽PPD比较反应(以OD值差值表示)检出14头,禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后,牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0.54。结果表明,牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核菌与环境分枝杆菌混合感染时,应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低,混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响,检测具有良好的特异性与敏感性。 展开更多
关键词 牛结核 IFN—γ 牛结核菌素 cfp10 ESAT6 禽结核菌素
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结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用 被引量:5
12
作者 王晓玮 程筱雯 +5 位作者 张焰 徐东芳 王东萍 韦薇 王庆 徐元宏 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2015年第9期1347-1351,共5页
以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比。表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10为0.5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg... 以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比。表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10为0.5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%。ELISPOT方法最佳实验条件为每孔细胞密度2×105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10μg/孔,细胞孵育时间20 h。ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88.50%、82.35%,检测结果与TSPOT·TB方法结果一致(χ2=0.57)。 展开更多
关键词 结核病诊断 Γ-干扰素 ELISPOT cfp10 ESAT6
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结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达 被引量:4
13
作者 张海 师长宏 +5 位作者 薛莹 姜泓 高雪 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《第四军医大学学报》 北大核心 2005年第3期193-195,共3页
目的:构建结核分枝杆菌esat6 cfp10融合基因疫苗 并对其在体外进行表达.方法:用PCR技术从MTB毒株 H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以HindⅢ和EcoRⅠ双 酶切后克隆入含esat6基因的pGEM 7zf(+)载体中,将测序 正确的esat6 cfp10融合基因按... 目的:构建结核分枝杆菌esat6 cfp10融合基因疫苗 并对其在体外进行表达.方法:用PCR技术从MTB毒株 H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以HindⅢ和EcoRⅠ双 酶切后克隆入含esat6基因的pGEM 7zf(+)载体中,将测序 正确的esat6 cfp10融合基因按照BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点 亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定 正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT PCR方法检测 mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果:PCR获得的cfp10基因序列与文献报道一致,大小约为 350bp.重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合 esat6 cfp10基因片段.RT PCR可获得大小约为350bp的 cfp10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6 Cfp10蛋白的阳 性细胞着染.结论:成功克隆结核分枝杆菌cfp10基因,构建 了融合有esat6 cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行 了表达. 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT6 cfp10 基因疫苗 真核表达
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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的原核表达及其表达条件的优化 被引量:5
14
作者 杨晰朦 陈香梅 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第3期286-292,共7页
目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件。方法以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pE... 目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件。方法以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-rEC,转化至感受态E. coli BL21(DE3),筛选优势菌株进行诱导表达,并对诱导温度(25、30、37℃)、诱导剂种类及浓度(0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1. 0 mmol/L IPTG及0. 5、1、5、10、15、20 g/L乳糖)、诱导时间(2、3、4、5、6 h)、诱导起始A600(0. 4、0. 6、0. 8、1. 0)进行优化。菌种经5 L发酵罐发酵培养后,采用亲和层析及离子交换层析纯化rEC融合蛋白,于-20℃分别储存0、2、4、6个月,12. 5%SDS-PAGE分析rEC融合蛋白,并对保存0、6月的样品进行HPLC-SEC分析。结果重组质粒pET-28a-rEC经双酶切及测序鉴定,构建正确。rEC融合蛋白最适诱导条件为:于30℃,以0. 1 mmol/L IPTG诱导4 h。纯化后rEC融合蛋白纯度达95%以上,且可与鼠抗ESAT6单克隆抗体发生特异性结合,于-20℃保存6个月未见蛋白降解及聚体产生。结论原核表达了rEC融合蛋白,并优化了其表达条件,获得的rEC融合蛋白具有较高纯度及稳定性。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT6 cfp10 基因重组 蛋白表达 稳定性
原文传递
结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因稳定表达细胞系的建立 被引量:3
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作者 张海 薛莹 +5 位作者 姜泓 高雪 师长宏 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第10期892-894,共3页
目的筛选并建立稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为结核杆菌DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型。方法以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pGEM610获得esat6-cfp10融合基因,克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴... 目的筛选并建立稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为结核杆菌DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型。方法以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pGEM610获得esat6-cfp10融合基因,克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,多轮筛选过后分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pCDNA610,RT-PCR结果证明esat6-cfp10融合基因已稳定整合在转染P815细胞染色体上,间接免疫荧光检测后表达有ESAT6-CFP10蛋白的阳性细胞着染。结论获得了稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测结核杆菌DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 ESAT6 cfp10 稳定表达
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牛分枝杆菌特异性四联融合蛋白在牛结核病诊断中的临床应用 被引量:5
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作者 吴波 张书环 +8 位作者 邓铨涛 项杰 陈军 刘朝 陈鑫 韩永佩 赵波 陈焕春 郭爱珍 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1123-1126,共4页
目的以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。方法用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。iELISA与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛... 目的以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。方法用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。iELISA与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本;以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国黑白花奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清;对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性。结果iELISA与ICG的符合率为93.33%(140/150),与TST的总符合率为87.32%(489/560),与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。结论该方法具有较高的灵敏度与特异性,与其它方法有较高的符合率。 展开更多
关键词 IELISA 融合蛋白 牛结核病 MPB70 MPB83 cfp10 ESAT-6
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结核病的特异性免疫诊断 被引量:5
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作者 姜永忠 《国外医学(预防.诊断.治疗用生物制品分册)》 2001年第3期116-120,共5页
经典的结核菌素 PPD试验对结核病的诊断特异性差 ,不能排除 BCG接种和非结核分枝杆菌感染。对结核杆菌特有的基因区的识别为研制高度特异性的新型诊断试剂提供机会 ,本文概述了特异性抗原 MPT6 4、ESAT 6和 CFP10用于准确。
关键词 结核病 特异性免疫诊断 MPT64 ESAT-6 cfp10
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Evaluation of Latent Tuberculosis Infection Using the ESAT6-CFP10 Skin Test Among International Freshmen With Diverse Skin Tones at a University—Nanjing City,Jiangsu Province,China,September 2023
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作者 Peng Lu Rong Wang +5 位作者 Jingjing Xu Jianming Wang Fangfang Du Guozhi Wang Shiming Cheng Limei Zhu 《China CDC weekly》 SCIE CSCD 2024年第35期896-900,I0001,共6页
Introduction:Newer skin tests,including the ESAT6-CFP10(EC)skin test,were recommended for diagnosing Mycobacterium tuberculosis(M.tb)infection.However,no data exist assessing the diagnostic performance of the EC skin ... Introduction:Newer skin tests,including the ESAT6-CFP10(EC)skin test,were recommended for diagnosing Mycobacterium tuberculosis(M.tb)infection.However,no data exist assessing the diagnostic performance of the EC skin test among foreign students with different skin tones.Methods:A cohort study at Nanjing Medical University screened incoming foreign freshmen.The EC skin test was used to assess for M.tb infection,and results were read at 24,48,72,and 96-hours postadministration.Results:Among 96 participants,M.tb infection rates at 24,48,72,and 96-hours post-injection were 3.13%,7.29%,13.54%,and 9.38%,respectively.While infection rates were lower among individuals with darker skin tones,the difference was not statistically significant(P=0.186),and variations were consistent across different measurement times.Trajectory analysis revealed 5.3%in the continuousincreasing group,86.5%in the low-stable group,and 5.2%in the elevated-decreasing group.Notably,participants in the elevated-decreasing group had lighter skin tones,with trajectory patterns consistent across different skin colors.Discussion:The EC skin test is safe,and redness diameter is a more reliable indicator than induration.Results should be collected within 48 to 72 hours,with verification at 72 hours crucial if initial results are negative.Importantly,skin color does not affect EC skin test outcomes. 展开更多
关键词 cfp10 SKIN NANJING
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结核分枝杆菌ESAT6、CFP10基因DNA疫苗对小鼠免疫原性的初步研究 被引量:4
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作者 王慧勤 李跃峰 +6 位作者 李志强 温书香 陈鹏博 赵庆亮 纪太旺 曹旭东 陈创夫 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期458-463,共6页
目的研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果。方法以构建的真核表达载体pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为:生理盐水组(SLYS)、卡介苗组(KJM)、pEGFP-N1... 目的研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果。方法以构建的真核表达载体pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为:生理盐水组(SLYS)、卡介苗组(KJM)、pEGFP-N1组(P-N1)、pEGFP-N1-ESAT6组(P-N1-E)、pEGFP-N1-CFP10组(P-N1-C)、卡介苗加pEGFP-N1组(K+P-N1)、卡介苗加pEGFP-N1-ESAT6组(K+P-N1-E)和卡介苗加pEGFP-N1-CFP10组(K+P-N1-C)。每只小鼠皮内注射100μL卡介苗,每只小鼠肌肉注射50μg质粒,每组共注射3次。以纯化的ESAT6、CFP10蛋白作为抗原,用DOT-ELISA方法检测小鼠血清中的抗体;用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ的变化。结果免疫3次后的小鼠血清中检测到针对CFP10蛋白的抗体,未检测到针对ESAT6蛋白的抗体。但二者血清中IFN-γ水平都有显著上升,K+P-N1-C和K+P-N1-E免疫3次后,测得的IFN-γ平均含量为(107.591±7.3281)pg/mL和(95.7503±9.0184)pg/mL,显著高于免前、一免、二免(P<0.01)。结论结核分枝杆菌ESAT6,CFP10基因DNA疫苗和卡介苗联合应用后可诱导小鼠产生有效的细胞免疫应答,为DNA疫苗的研究奠定一定的基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT6 cfp10 DNA疫苗 卡介苗
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结核分枝杆菌ESAT6基因真核表达载体的构建及表达 被引量:4
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作者 李跃峰 付强 +6 位作者 张俊波 史慧君 李志强 程婷婷 张辉 曹旭东 陈创夫 《石河子大学学报(自然科学版)》 CAS 2013年第3期318-322,共5页
为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于p... 为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将ESAT6基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6。用重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6转染293T细胞。结果显示:重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6测序结果正确,转染细胞后出现绿色荧光,经Western blot分析鉴定,可见约35kDa的预期蛋白条带,证实ESAT6-EGFP融合蛋白在293T细胞中获得了表达。研究结果为进一步研究毒力因子ESAT6在感染宿主细胞中所发挥胞内生存机制奠定了基础。 展开更多
关键词 结核病 ESAT6 cfp10
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