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牛病毒性腹泻病毒基因分型双重RT-PCR方法的建立 被引量：4
1
作者 熊浩 季新成 +4 位作者 王克栋 史茜 冉多良 彭武丽 于学辉 《中国动物检疫》 CAS 2013年第4期39-42,共4页
根据GenBank已发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因Ⅰ型和Ⅱ型5’端非编码区(5’-UTR)保守序列,设计两对针对基因Ⅰ型和Ⅱ型的特异性引物,经反应条件的优化,建立了在同一反应体系中同时检测BVDV基因Ⅰ型和Ⅱ型的RT-PCR方法。该方法对两个... 根据GenBank已发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因Ⅰ型和Ⅱ型5’端非编码区(5’-UTR)保守序列,设计两对针对基因Ⅰ型和Ⅱ型的特异性引物,经反应条件的优化,建立了在同一反应体系中同时检测BVDV基因Ⅰ型和Ⅱ型的RT-PCR方法。该方法对两个基因型的病毒检测灵敏度均为2TCID50,只比单重PCR的灵敏度低了10倍。且具有较好的特异性和可重复性。经临床应用验证,该方法可用来对两个基因型的BVDV进行同步分型检测。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒基因I型 牛病毒性腹泻病毒基因II型 双重RT-PCR 共扩增
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致牛呼吸道疾病综合征主要病毒SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法的建立与应用 被引量：8
2
作者 姜晓霞 孙晓波 +5 位作者 王以欣 张晓梅 赵毅 乔薪瑗 徐义刚 贾烁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期269-277,共9页
为鉴别检测引起牛呼吸道疾病综合征的主要病毒性病原,包括牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒(BPIV),本研究分别以IBRV g B基因、BVDV 5′-UTR基因、BRSV N基因和BPIV HN基... 为鉴别检测引起牛呼吸道疾病综合征的主要病毒性病原,包括牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒(BPIV),本研究分别以IBRV g B基因、BVDV 5′-UTR基因、BRSV N基因和BPIV HN基因为靶基因,通过BLAST比对,基于靶基因的保守区域设计引物,经过反应体系优化,建立了检测IBRV、BVDV、BRSV和BPIV的单一和多重SYBR GreenⅠ实时PCR方法。结果显示,建立的方法检测灵敏性高,对IBRV、BVDV、BRSV和BPIV的最低检测限分别为5.86×10^(1)、5.02×10^(1)、1.02×10^(2)和2.42×10^(1)copies/μL。检测特异性强,仅IBRV、BVDV、BRSV和BPIV为方法阳性,其他病毒均为阴性。采集了259份临床表现为呼吸道疾病症状的牛血液样本,利用建立的方法进行检测,结果显示,阳性检出率分别为BVDV 22.78%、BPIV 11.97%、IBRV 5.02%、BRSV 31.66%,经基因测序复核,本方法的检测准确率为100%。此外,在阳性样本中存在多种病毒混合感染的情况,其中BRSV和BVDV混合感染率为5.02%,BRSV和BPIV混合感染率为3.47%,BPIV和BVDV混合感染率为1.93%,BRSV和IBRV混合感染率为1.16%,BRSV、BVDV和BPIV混合感染率为0.39%。以上结果表明,本研究建立的方法具有良好的检测灵敏性、特异性和准确性,可同时检测IBRV、BVDV、BPIV和BRSV,为病毒性牛呼吸道疾病综合征主要病原的快速检测和流行病学调查提供了必要的技术支持。 展开更多
关键词 牛呼吸道疾病综合征 牛传染性鼻气管炎病毒 牛病毒性腹泻病毒 牛副流感病毒 牛呼吸道合胞体病毒 SYBR Greenⅰ实时PCR方法
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基因Ⅰ型和Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒双重TaqMan荧光定量PCR的建立及应用 被引量：4
3
作者 王艳杰 王秀明 +7 位作者 张宸 王云凌 陈君彦 张贵刚 范秀丽 张妍 魏学峰 刘国英 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期692-696,共5页
为对基因Ⅰ型和Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)进行鉴别检测,本研究根据GenBank中已登录的基因Ⅰ型和Ⅱ型BVDV 5'非编码区(5'-UTR)的参考序列,设计了一对BVDV Ⅰ型和Ⅱ型通用引物和2条鉴别探针,建立了Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧... 为对基因Ⅰ型和Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)进行鉴别检测,本研究根据GenBank中已登录的基因Ⅰ型和Ⅱ型BVDV 5'非编码区(5'-UTR)的参考序列,设计了一对BVDV Ⅰ型和Ⅱ型通用引物和2条鉴别探针,建立了Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,并利用该检测方法进行临床样品检测。特异性试验结果显示,除Ⅰ型和Ⅱ型BVDV外,该方法对猪瘟、牛传染性鼻气管炎、口蹄疫病毒等均无扩增曲线。敏感性试验结果显示,该方法对Ⅰ型BVDV检测下限为10拷贝/μL,Ⅱ型BVDV检测下限为100拷贝/μL,敏感性高。重复性试验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于1%。临床样品检测结果显示,Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可鉴别Ⅰ型和Ⅱ型BVDV,检测结果与OIE认可的BVDV普通PCR扩增产物测序结果一致。本研究所建立的Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR具有快速、准确、可鉴别等优点,可用于Ⅰ型和Ⅱ型BVDV的快速鉴别检测。 展开更多
关键词 bvdvⅰ型 bvdvⅡ型 TaqMan荧光定量PCR
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牛病毒性腹泻病毒SYBR Green I实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：6
4
作者 韩猛立 黄新 +1 位作者 钟发刚 唐思静 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期333-339,共7页
[目的]在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光定量RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的BVDV 5′端非编码区（5′ UTR）核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.[... [目的]在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光定量RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的BVDV 5′端非编码区（5′ UTR）核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.[结果]建立的方法只能检测到BVDV,而与猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒及牛冠状病毒没有交叉反应,具有高度的特异性;在102～108copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.998,最低可检测下限可达到102 copies/μL,具有灵敏度高的特点;不同情况下3次重复实验,变异系数均小于1.5％,具有重复性好的特点.[结果]成功建立了一种用于检测BVDV的实时荧光定量RT-PCR技术,并可用于临床样品的检测,适用于BVDV的快速诊断和流行病学调查. 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 实时荧光定量RT-PCR SYBR Green ⅰ
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BVDV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法与RT-PCR方法的建立与应用 被引量：3
5
作者 马鹏 李林杰 +5 位作者 常秋燕 王悦萦 郭富城 刘萍 马晓霞 马忠仁 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2017年第A01期49-53,共5页
利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的R... 利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(bvdv) RT-PCR SYBR Greenⅰ荧光定量PCR 应用
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猪源牛病毒性腹泻病毒1型分离株的鉴定及培养特性研究 被引量：3
6
作者 陶洁 李本强 +2 位作者 程靖华 马玉飞 刘惠莉 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期1555-1561,共7页
利用RT-PCR方法从猪场腹泻样品中检测到牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核酸阳性样品,测序证实为1型BVDV,命名为SHCM06。遗传进化分析表明,其与ZM-95亲缘性最近,同源性达98.3%;与BVDV-1经典毒株亲缘性较远,仅85.7%~89.8%。免疫荧光、Western-blo... 利用RT-PCR方法从猪场腹泻样品中检测到牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核酸阳性样品,测序证实为1型BVDV,命名为SHCM06。遗传进化分析表明,其与ZM-95亲缘性最近,同源性达98.3%;与BVDV-1经典毒株亲缘性较远,仅85.7%~89.8%。免疫荧光、Western-blot和荧光定量RT-PCR检测均表明,SHCM06毒株可感染MDBK、ST和PK15细胞,在MDBK和ST细胞上的增殖效率显著高于PK15细胞。进一步分析SHCM06感染对细胞中Ⅰ型干扰素表达的影响,结果显示,SHCM06感染均能使3种细胞中IFN-α和IFN-β表达量显著下降(P<0.05),且对MDBK细胞IFN-α的抑制效果显著高于对PK15细胞中IFN-α的抑制作用(P<0.05)。结果表明,从猪临床腹泻样品中分离1株BVDV1型,该病毒对MDBK、ST细胞适应性好于PK-15细胞,能显著抑制细胞中Ⅰ型IFN的产生,以发挥抵抗细胞抗病毒免疫效应,本试验为深入研究猪源BVDV的致病作用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪源bvdv 同源性分析 生长特性 ⅰ型干扰素
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