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DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立 被引量：3
1
作者 王宇 阎瑾琦 +2 位作者 张亮 王越 于继云 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期304-306,共3页
目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo... 目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以NotI和BamHI双酶切以及测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒以Lipo-fectamineTM2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达。结果双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明DC-SIGN基因与原序列一致。pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了稳定表达DC-SIGN分子的细胞系。流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%。免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面。Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带。结论成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 基因 DC-SIGN bhk21细胞系 树突细胞
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稳定表达SLAM受体的Vero和BHK21细胞系的建立及其对犬瘟热病毒分离效果的比较 被引量：1
2
作者 朱璐 燕霞 +9 位作者 代科 王正皓 赵玉佳 杨振 文心田 曹三杰 黄小波 伍锐 赵勤 文翼平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期1212-1221,共10页
旨在构建稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,并比较其对犬瘟热病毒(CDV)野毒株的敏感性,为CDV野毒株的快速分离与研究提供一种有效的工具。将真核表达载体Pcag-SLAM分别转染Vero细胞和BHK21细胞。经G418压力筛选结... 旨在构建稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,并比较其对犬瘟热病毒(CDV)野毒株的敏感性,为CDV野毒株的快速分离与研究提供一种有效的工具。将真核表达载体Pcag-SLAM分别转染Vero细胞和BHK21细胞。经G418压力筛选结合有限稀释法筛选阳性克隆株,并通过RT-PCR、间接免疫荧光鉴定(IFA)和Western blot等方法对稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系加以验证。应用这两种细胞系对3例临床犬瘟热病例的5种不同组织进行病毒分离,对分离得到的CDV进行RT-PCR及IFA鉴定。结果显示,经RT-PCR和Western blot验证,本研究成功构建出SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,SLAM-Vero细胞接种病毒12~24h即可出现典型的CDV导致的细胞融合体CPE,利用SLAM-Vero细胞从3只CDV阳性犬的肺和脾中分离得到2株CDV,而SLAM-BHK21细胞、亲本Vero细胞及亲本BHK21细胞未能分离出病毒。研究表明,与SLAM-BHK21细胞相比,SLAM-Vero细胞对CDV的分离率较高,并能产生明显的CPE。在分离CDV野毒株时,选择肺和脾更容易在SLAM-Vero细胞系上分离出病毒。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 信号淋巴激活分子 Vero细胞系 bhk21细胞系
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应用BHK_(21)细胞检测汉坦病毒中和抗体方法的建立
3
作者 王晓宇 付增武 +2 位作者 惠连 洪成龙 韩亮 《微生物学免疫学进展》 2001年第1期52-54,共3页
本文报道应用汉坦病毒 (HV)Ⅰ型 76 118、Chen、J3、J5、J12 ,和Ⅱ型UR、R2 2 、L99等 8株病毒在BHK2 1细胞上培养和观察 ,发现病毒感染BHK2 1细胞后可规律出现病变 ,且可测出病毒滴度。分别应用BHK2 1细胞与Vero E6细胞同时做空斑减... 本文报道应用汉坦病毒 (HV)Ⅰ型 76 118、Chen、J3、J5、J12 ,和Ⅱ型UR、R2 2 、L99等 8株病毒在BHK2 1细胞上培养和观察 ,发现病毒感染BHK2 1细胞后可规律出现病变 ,且可测出病毒滴度。分别应用BHK2 1细胞与Vero E6细胞同时做空斑减少中和试验 (PRNT)检测同批血清的抗体中和效价 ,结果一致 ,且稳定性特异性好 ,因此BHK2 1细胞可作为研究HV的另一个敏感实验细胞系 。 展开更多
关键词 汉坦病毒 空斑减少中和试验 bhk21细胞系 中和抗体 检测
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稳定表达犬瘟热病毒细胞受体SLAM的BHK-21/SLAM细胞系的建立 被引量：5
4
作者 朱颖 刘文鑫 +6 位作者 赵姝静 李丹丹 冯瑜菲 关玮琨 何丽丽 江馗语 师东方 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期440-443,共4页
为建立稳定表达犬瘟热病毒(CDV)受体,即信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的BHK-21细胞系,本研究将重组表达质粒pDisplay-SLAM转染于BHK-21细胞,通过G418压力筛选并结合有限稀释法、免疫荧光、RT-PCR和western blot筛选出稳定表达SLAM的阳性细... 为建立稳定表达犬瘟热病毒(CDV)受体,即信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的BHK-21细胞系,本研究将重组表达质粒pDisplay-SLAM转染于BHK-21细胞,通过G418压力筛选并结合有限稀释法、免疫荧光、RT-PCR和western blot筛选出稳定表达SLAM的阳性细胞(BHK-21/SLAM)。病毒感染试验结果显示,CDV在BHK-21细胞中无细胞病变(CPE)产生,而感染BHK-21/SLAM细胞12 h后即可出现CPE;BHK-21/SLAM细胞培养物上清液中的CDV核酸含量于24 h达到最高值(107.9拷贝/μL),明显高于对照组BHK-21细胞培养物上清液中的核酸含量(106.28拷贝/μL)。研究结果表明,与BHK-21细胞相比较,CDV在BHK-21/SLAM细胞中的病毒核酸含量更高,并能够产生明显的CPE。该细胞系的建立在CDV的分离、生物学特性研究和疫苗毒生产等方面具有良好应用前景。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 信号淋巴细胞激活因子 bhk-21细胞系 bhk-21 SLAM细胞系
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猪乙脑病毒分离株BSF．ZZ-1和BSF．ZZ-3在BHK-21细胞上的传代培养及E基因序列稳定性分析 被引量：3
5
作者 胡博 滕蔓 +5 位作者 禹乐乐 罗俊 迟佳琪 宿靖伟 柴书军 张改平 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2013年第6期71-76,共6页
为研究猪乙脑病毒(JEV)分离株遗传基因的稳定性,将JEV分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代60次后病毒E基因趋于稳定,BSF.ZZ-1毒株E蛋白氨基酸位点E21(A→V... 为研究猪乙脑病毒(JEV)分离株遗传基因的稳定性,将JEV分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代60次后病毒E基因趋于稳定,BSF.ZZ-1毒株E蛋白氨基酸位点E21(A→V)、E200(T→A)、E244(G→E)、E279(M→K)和E426(G→D),以及BSF.ZZ-3毒株的E244(G→E)、E255(F→L)、E285(M→L)、E368(L→S)和E497(N→S)传代后发生稳定点突变。与JEV毒力相关的部分位点如E107、E138、E176、E177和E315遗传稳定性较高,经连续传代后均未发生突变,与疫苗株SA14-14-2相应位点完全一致。但是,另外一些位点的遗传稳定性较差,如BSF.ZZ-3的E279(M→K→M)出现反复突变。这些突变是否与JEV的宿主细胞适应性及毒力变化相关有待进一步研究。 展开更多
关键词 乙脑病毒 BSF.ZZ-1 BSF.ZZ-3 bhk-21细胞系 传代培养 E基因 序列分析
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BHK-21细胞库的建立及其生物学特性鉴定 被引量：3
6
作者 付智财 王家敏 +8 位作者 令世鑫 沈武玲 平玲 魏园园 马桂兰 暴艳敏 徐水林 马忠仁 乔自林 《山西农业科学》 2013年第8期808-812,共5页
从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株BHK-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果... 从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株BHK-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果显示,2个来源的BHK-21细胞系均呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体为21对,二倍体均占主体;外源质粒在该2株细胞系中能进行复制和表达。这可为开展BHK-21细胞系及口蹄疫疫苗的研究与开发提供基础理论依据和细胞资源。 展开更多
关键词 bhk-21细胞系 细胞库 生物学特性
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稳定表达Cas9蛋白的BHK-21单克隆细胞系的建立与鉴定 被引量：1
7
作者 葛丽娟 权冉 +4 位作者 陈俊贞 袁圆圆 付强 李泽宇 史慧君 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2022年第9期12-17,共6页
为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选... 为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选,筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞,利用Western blot检测Cas9蛋白的表达。为获得Cas9活性强的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,根据紧密连接蛋白(OCLN)基因序列,设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒,测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染BHK-21-Cas9单克隆细胞系。使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,经过Western blot检测OCLN蛋白的表达。Western blot检测Cas9蛋白结果显示,共获得了17株BHK-21-Cas9单克隆细胞系;测序结果显示,lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功,通过Western blot鉴定,有2株Cas9编辑效果好、具有高敲除效率的BHK-21单克隆细胞系。结果表明,本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,可以用于CRISPR/Cas9敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据。 展开更多
关键词 Cas9蛋白 bhk-21细胞系 慢病毒 紧密连接蛋白
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过表达TPL2蛋白BHK21细胞系的建立及其初步应用 被引量：1
8
作者 郝军红 闫鸣昊 +7 位作者 张大俊 张学刚 申超超 徐国伟 李国丽 张克山 郑海学 刘湘涛 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1527-1534,共8页
利用慢病毒表达系统将TPL2(COT和MAP3K8)质粒稳定整合在乳仓鼠肾细胞(baby Hamster Syrian kidney)BHK21细胞基因组染色体上,建立稳定表达TPL2的BHK21/TPL2细胞系。构建TPL2质粒,通过基因合成将TPL2基因和慢病毒载体Lv-PCDH连接,得到重... 利用慢病毒表达系统将TPL2(COT和MAP3K8)质粒稳定整合在乳仓鼠肾细胞(baby Hamster Syrian kidney)BHK21细胞基因组染色体上,建立稳定表达TPL2的BHK21/TPL2细胞系。构建TPL2质粒,通过基因合成将TPL2基因和慢病毒载体Lv-PCDH连接,得到重组慢病毒载体Lv-TPL2。通过嘌呤霉素筛选得到的阳性细胞株BHK21/TPL2即为稳定表达TPL2蛋白的BHK21细胞株。运用间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、实时荧光定量PCR和普通PCR等技术分别验证TPL2基因组整合、转录、反应活性以及FMDV、SVV在BHK21/TPL2细胞株上的增殖效果。结果,TPL2基因被稳定整合在BHK21细胞基因组染色体上,建立的细胞系连续传代不丢失。接种病毒后致细胞病变严重,相对于正常的BHK21/PCDH细胞,整合有TPL2的BHK21细胞对FMDV、SVV的易感性显著增强。上述结果为FMDV疫苗的研制和生产提供了更佳的功能细胞系。 展开更多
关键词 TPL2基因 bhk-21细胞系 口蹄疫病毒 SVV病毒 慢病毒表达系统
原文传递
逆转录病毒载体介导的稳定表达口蹄疫病毒3D基因的BHK21细胞系的建立 被引量：1
9
作者 毕研丽 沈小燕 +3 位作者 丛国正 刘湘涛 常惠芸 才学鹏 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1115-1120,共6页
【目的】研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在BHK-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。【方法】从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pBPSTR1... 【目的】研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在BHK-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。【方法】从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pBPSTR1-3D。用pBPSTR1-3D和pVSV-G双质粒瞬时转染GP2-293包装细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染BHK-21细胞,嘌呤霉素持续筛选12d后获得阳性克隆,并用有限稀释法挑选单个阳性细胞克隆。【结果】应用PCR、RT-PCR技术可从体外反复传代的阳性细胞中扩增到3D基因,证实目的外源基因能转录并被稳定整合进宿主细胞基因组中。经SDS-PAGE、Westernblot、间接免疫荧光检测到在不同代次的阳性细胞中有目的蛋白表达。【结论】本试验利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将外源基因插入到靶细胞的基因组中,构建了稳定表达口蹄疫病毒RNA聚合酶的包装细胞系,为研究3D基因表达及其蛋白定位提供了方便,也为下一步研究RNA聚合酶生物学功能和疫苗研制提供了科学依据。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3D基因 逆转录病毒载体pBPSTR1 bhk-21细胞系
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不同牛血清培养BHK-21细胞系的试验 被引量：1
10
作者 胡世华 陈应理 +2 位作者 杨敏 宋明兰 王宗子 《中国兽医科技》 CSCD 1990年第7期25-28,共4页
细胞培养技术已广泛应用于疫苗生产。本试验用不同品种不同年龄牛血清培养BHK-21细胞系,定期检测细胞的生长速率、形态、微生物污染及染色体变化等指标,以明确生产生物制品所用细胞的选择标准,进一步提高疫苗质量。(一)材料和方法1.试... 细胞培养技术已广泛应用于疫苗生产。本试验用不同品种不同年龄牛血清培养BHK-21细胞系,定期检测细胞的生长速率、形态、微生物污染及染色体变化等指标,以明确生产生物制品所用细胞的选择标准,进一步提高疫苗质量。(一)材料和方法1.试验材料:(1)BHK-21细胞系:代号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,其中Ⅰ、Ⅱ分别于1986年、1987年由中国兽药监察所购回,Ⅲ为1988年本所疫苗车间提供。 展开更多
关键词 牛 血清 培养 bhk-21细胞系 疫苗
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