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新城疫病毒TS09耐热株在BHK细胞上的传代培养 被引量：8
1
作者 温国元 商雨 +5 位作者 郭静 杨峻 王红琳 罗青平 张蓉蓉 邵华斌 《湖北农业科学》 北大核心 2012年第23期5424-5427,5435,共5页
以新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)TS09耐热株为研究对象,研究了该毒株在幼仓鼠肾传代细胞(BHK细胞)上的培养适应性。通过培养条件的优化、连续传代培养和极限稀释法纯化,获得了一株新的、纯化的、适应BHK细胞的NDV耐热株,命名... 以新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)TS09耐热株为研究对象,研究了该毒株在幼仓鼠肾传代细胞(BHK细胞)上的培养适应性。通过培养条件的优化、连续传代培养和极限稀释法纯化,获得了一株新的、纯化的、适应BHK细胞的NDV耐热株,命名为TS09-C株。TS09-C株的生物学特性测定结果表明,TS09-C株在BHK细胞中的增殖滴度为107.9TCID50/mL,平均鸡胚致死时间(MDT)大于120 h,脑内致病指数(ICPI)为0。与亲本株TS09株相比,TS09-C株的基因序列发生了较为明显的改变,但TS09-C株与亲本株仍保持着较近的遗传进化关系。 展开更多
关键词 新城疫病毒(Newcastle Disease Virus NDV) 耐热 bhk细胞 传代
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启动子CMV和EF1α对人胰岛素基因在BHK细胞中表达的影响 被引量：3
2
作者 李华 刘维全 +4 位作者 王萍 王吉贵 董婉维 王禄增 齐顺章 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2003年第1期18-22,共5页
目的　构建人胰岛素基因真核高效表达载体 ,为胰岛素转基因研究奠定基础。方法　用限制性内切酶SpeⅠ和HindⅢ消化pEF1α GFP ,回收 1 2kbEF1α启动子 ,插入到pCMV mINS的NruⅠ和HindⅢ位点中 ,获得重组质粒pEF1α mINS ;将pCMV mINS和p... 目的　构建人胰岛素基因真核高效表达载体 ,为胰岛素转基因研究奠定基础。方法　用限制性内切酶SpeⅠ和HindⅢ消化pEF1α GFP ,回收 1 2kbEF1α启动子 ,插入到pCMV mINS的NruⅠ和HindⅢ位点中 ,获得重组质粒pEF1α mINS ;将pCMV mINS和pEF1α mINS分别转染BHK细胞 ,用G418筛选 ,阳性克隆传至 2 0代后 ,分别用放免方法和免疫组化法分析胰岛素和 或胰岛素原在BHK细胞中的表达情况。结果　经放免测定 ,pCMV mINS和pEF1α mINS在BHK细胞中胰岛素和 或胰岛素原的表达量分别为 4 0 77μIU ml和 6 897μIU ml。经免疫组化分析 ,pCMV mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 190 0± 19 5 6 ;pEF1α mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 181 4± 18 45 ,在BHK细胞核中表达水平的灰度值为 15 5 4± 11 6 6。结论　在BHK细胞中启动子EF1α启动胰岛素基因表达的活性比启动子CMV高。 展开更多
关键词 启动区 遗传学 人胰岛素基因 bhk细胞 表达
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稳定表达人TMPRSS2基因BHK细胞系的建立及其对新城疫弱毒增殖效率评价 被引量：3
3
作者 刘伟 李梦娇 +7 位作者 郭佩东 孙英杰 仇旭升 谭磊 宋翠萍 廖瑛 孟春春 丁铲 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期594-600,共7页
为提高细胞培养系统中新城疫病毒的增殖效率,通过构建TMPRSS2过表达的BHK细胞系,探索其对新城疫弱毒增殖的影响。本研究将TMPRSS2基因克隆于噬菌体载体pHAGE中,构建重组质粒pHAGE-TMPRSS2。将重组质粒pHAGE-TMPRSS2以及辅助包装质粒psP... 为提高细胞培养系统中新城疫病毒的增殖效率,通过构建TMPRSS2过表达的BHK细胞系,探索其对新城疫弱毒增殖的影响。本研究将TMPRSS2基因克隆于噬菌体载体pHAGE中,构建重组质粒pHAGE-TMPRSS2。将重组质粒pHAGE-TMPRSS2以及辅助包装质粒psPAX2和pMD2G共转染至293T细胞并收集上清。将包装好的慢病毒感染BHK细胞,通过Blasticidin加入筛选和有限稀释法将单克隆细胞扩大培养。经RT-PCR和Western-blot鉴定,结果表明,TMPRSS2在BHK细胞中获得了稳定的高表达。接种新城疫弱毒后通过TCID50测定显示,TMPRSS2过表达BHK细胞系能支持较高水平的病毒增殖。 展开更多
关键词 TMPRSS2 慢病毒包装 bhk细胞 新城疫弱毒
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α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中的表达
4
作者 侯小强 高玉伟 +2 位作者 孙培录 夏咸柱 杨松涛 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第1期22-24,共3页
目的在BHK细胞中表达α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1),为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶的cDNA,克隆入载体pMD18-T中,测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒... 目的在BHK细胞中表达α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1),为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶的cDNA,克隆入载体pMD18-T中,测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ST6Gal1,并转染BHK细胞,免疫荧光法检测α-2,6唾液酸转移酶的表达。结果克隆的α-2,6唾液酸转移酶基因与GenBank中报道的已知序列完全一致,重组真核表达质粒转染的BHK细胞表面SAα2,6Gal含量增加。结论α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中获得了有效表达,为流感病毒受体的研究提供了技术支持。 展开更多
关键词 α-2 6唾液酸转移酶 bhk细胞 克隆 表达
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牛坏死杆菌43kDa外膜蛋白真核质粒在BHK细胞中的瞬时表达
5
作者 张思瑶 王志慧 +5 位作者 贺显晶 蒋剑成 汪锋锋 王丽娜 肖佳薇 郭东华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第2期149-151,156,共4页
目的构建含有牛坏死杆菌43 kDa外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因的真核表达重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,并检测其在BHK细胞中的瞬时表达。方法将43 kDa OMP核苷酸全基因序列与pCAGGS-HA载体连接,构建重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP... 目的构建含有牛坏死杆菌43 kDa外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因的真核表达重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,并检测其在BHK细胞中的瞬时表达。方法将43 kDa OMP核苷酸全基因序列与pCAGGS-HA载体连接,构建重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,转化至大肠埃希菌,将鉴定正确的阳性菌转染BHK细胞,采用间接免疫荧光和Western blot法检测重组蛋白的表达。结果经双酶切及PCR鉴定,重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP构建正确;转染pCAGGS-43 kDa OMP的BHK细胞镜下观察可见绿色荧光,Western blot检测可见相对分子质量为43 000的目的蛋白。结论成功构建了pCAGGS-43 kDa OMP真核表达质粒,可在BHK细胞中瞬时表达,为进一步研究牛坏死杆菌感染机制奠定了基础。 展开更多
关键词 牛坏死杆菌 外膜蛋白 bhk细胞 瞬时表达
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重组减毒沙门菌ΔcrpSL1344(pET28-tPA)在BHK细胞中的表达及活性检测
6
作者 杨宁宁 李银聚 +2 位作者 程相朝 张春杰 吴庭才 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第9期17-20,167,共5页
为了探讨原核表达质粒中的真核基因在减毒沙门菌中表达的多肽是否能在真核细胞中加工修饰成具有生物活性的蛋白,试验根据人t-PA的编码序列设计1对引物,扩增t-PA目的基因片段,构建pET28-tPA原核表达质粒,将表达质粒电转化导入减毒鼠伤寒... 为了探讨原核表达质粒中的真核基因在减毒沙门菌中表达的多肽是否能在真核细胞中加工修饰成具有生物活性的蛋白,试验根据人t-PA的编码序列设计1对引物,扩增t-PA目的基因片段,构建pET28-tPA原核表达质粒,将表达质粒电转化导入减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpSL1344中并转染BHK细胞,应用SDS-PAGE技术检测t-PA表达情况,ELISA法检测其表达水平,琼脂糖平板溶圈法检测纤溶活性。结果表明:重组菌ΔcrpSL1344(pET28-tPA)在BHK细胞中有66.0 ku的蛋白表达,转染96 h的表达量为108μg/L,细胞裂解液和转染表达质粒的细胞培养上清液均有促纤溶活性。说明携带t-PA原核表达质粒的减毒沙门菌具有较强的促纤溶活性。 展开更多
关键词 减毒鼠伤寒沙门菌 表达质粒 组织型纤溶酶原激活剂(t—PA) bhk细胞 活性检测
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猪白介素18基因在BHK细胞中的表达
7
作者 王笑笑 宗瑞谦 +3 位作者 吕转萍 窦永喜 宋世斌 景志忠 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2007年第6期23-27,共5页
将猪白介素18(Porcine interleukin18,PIL-18)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建了重组表达质粒pEGFP-PIL-18,利用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR检测技术确定目的蛋白的表达情况.结果在转染重组质粒24 h4... 将猪白介素18(Porcine interleukin18,PIL-18)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建了重组表达质粒pEGFP-PIL-18,利用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR检测技术确定目的蛋白的表达情况.结果在转染重组质粒24 h4、8 h后的BHK细胞中均观察到绿色荧光,转染的BHK细胞经G418筛选14 d后,用RT-PCR法检测目的基因,并扩增到长576 bpd的目的cDNA片段。表明在BHK细胞中成功地表达了PIL-18与EGFP的融合蛋白,这为下一步建立稳定表达PIL-18的细胞系奠定了基础. 展开更多
关键词 猪白介素18 转染 bhk细胞 真核表达
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逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达 被引量：9
8
作者 李炯 刘艳红 +4 位作者 安芳兰 刘俊林 刘湘涛 尚佑军 殷宏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期376-382,共7页
为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病... 为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 口蹄疫病毒 衣壳前体基因 绿色荧光蛋白基因 bhk-21细胞
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羊口疮病毒ORF129基因重组质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达 被引量：10
9
作者 白刚 贾怀杰 +4 位作者 何小兵 王盈盈 何妍萍 吴润 景志忠 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期8-13,共6页
为研究羊口疮病毒(ORFV)ORF129基因编码的锚蛋白调节宿主天然免疫应答的作用机制,利用PCR技术对ORFV/QH01/2010分离株ORF129基因进行扩增,并连接到pGEM-T easy载体,构建pGEM-ORF129重组质粒,双酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEG... 为研究羊口疮病毒(ORFV)ORF129基因编码的锚蛋白调节宿主天然免疫应答的作用机制,利用PCR技术对ORFV/QH01/2010分离株ORF129基因进行扩增,并连接到pGEM-T easy载体,构建pGEM-ORF129重组质粒,双酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-ORFV-ORF129真核表达质粒,经酶切、PCR鉴定及测序正确后转染BHK-21细胞,观察其在细胞中的表达情况.结果表明:ORFV ORF129基因在BHK-21细胞中获得稳定表达,并为进一步研究其编码蛋白在ORFV感染过程中的分子机制奠定了基础. 展开更多
关键词 羊口疮病毒 ORF129基因 bhk-21细胞 融合表达
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不同新生牛血清对体外培养BHK-21细胞的影响 被引量：8
10
作者 孙招金 陈柄企 +3 位作者 王玲 叶贺佳 童菊芸 罗开健 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第7期862-864,共3页
目的比较不同新生牛血清对体外培养的BHK-21细胞的影响。方法以不同厂家和同一厂家不同批次的共6种新生牛血清培养BHK-21细胞,观察细胞传代后在不同血清培养条件下的形态、增长倍数和细胞维持时间。结果 6号血清培养的细胞生长状态最好... 目的比较不同新生牛血清对体外培养的BHK-21细胞的影响。方法以不同厂家和同一厂家不同批次的共6种新生牛血清培养BHK-21细胞,观察细胞传代后在不同血清培养条件下的形态、增长倍数和细胞维持时间。结果 6号血清培养的细胞生长状态最好,增长倍数最高,维持细胞存活时间最长;3号血清培养效果次之;2号、4号和5号血清培养的细胞至第4天仍未长满单层;1号血清培养的细胞基本未生长。结论不同厂家和同一厂家不同批次的新生牛血清对BHK-21细胞体外培养的效果存在差异。 展开更多
关键词 血清 bhk-21细胞 细胞形态
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BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响 被引量：6
11
作者 于义娟 秦涛 +9 位作者 闵娟娟 漆世华 靖志强 付娅 李晶梅 廖园园 舒银辉 朱薇 徐松 谢红玲 《中国兽药杂志》 北大核心 2017年第11期28-35,共8页
为分析BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响,分别用甲醛、二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯(BPL)进行灭活和在-20℃进行冻融处理的BHK-21细胞接种裸鼠,通过病理组织形态学观察判定其是否存在致肿瘤的特性。结果显示,甲醛、BEI、BPL、冻... 为分析BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响,分别用甲醛、二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯(BPL)进行灭活和在-20℃进行冻融处理的BHK-21细胞接种裸鼠,通过病理组织形态学观察判定其是否存在致肿瘤的特性。结果显示,甲醛、BEI、BPL、冻融2次或3次分别处理的BHK-21细胞接种裸鼠,对裸鼠致瘤率为零。冻融1次的BHK-21细胞和10~7、10~5和10~3个BHK-21细胞分别接种裸鼠,致瘤率为100%。10个BHK-21细胞接种裸鼠,未见成瘤。试验表明,裸鼠检测BHK-21细胞致瘤性敏感性为10~3个细胞;冻融2次、甲醛、BEI、BPL处理,BHK-21细胞均丧失致瘤性;冻融1次不能使BHK-21细胞丧失致瘤性。 展开更多
关键词 bhk-21细胞 裸鼠 致瘤性
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蛋清溶菌酶对人单纯疱疹病毒Ⅰ型抑制作用的实验研究 被引量：6
12
作者 李亚男 刘洪臣 +2 位作者 杨丽 宫琦玮 李红梅 《军医进修学院学报》 CAS 北大核心 2008年第6期517-519,共3页
目的:观察蛋清溶菌酶(HEWL)对人单纯疱疹病毒I型(hHSV-1)的抑制作用。方法:以HSV-1的敏感细胞BHK-21为实验细胞模型,以更昔洛韦为阳性对照药,以0.5%12-烷基磺酸钠(SDS)为阻断剂,采用细胞病变法(CPE)判定溶菌酶对hHSV-1的抑制效果。结果:... 目的:观察蛋清溶菌酶(HEWL)对人单纯疱疹病毒I型(hHSV-1)的抑制作用。方法:以HSV-1的敏感细胞BHK-21为实验细胞模型,以更昔洛韦为阳性对照药,以0.5%12-烷基磺酸钠(SDS)为阻断剂,采用细胞病变法(CPE)判定溶菌酶对hHSV-1的抑制效果。结果:HEWL对细胞的最大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)均>1 000μg.mL-1,HEWL对hHSV-1抑制作用的最小有效浓度(MIC)为104.17μg.mL-1,半数有效浓度(IC50)为46.88μg.mL-1,治疗指数(TI)为10.67。在平行对照试验中,更昔洛韦对BHK-21细胞的TC0和TC50均>500μg.mL-1。更昔洛韦对hHSV-1抑制作用的MIC为7.81μg.mL-1,IC50为3.91μg.mL-1,TI为64。0.5%SDS完全阻断了HEWL的抗病毒能力。结论:蛋清溶菌酶对HSV-1有较明显的抑制作用,作用强度与溶菌酶的浓度相关。 展开更多
关键词 胞壁质酶 bhk-21细胞 更昔洛韦 单纯疱疹病毒I型 人
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BHK21细胞冻存密度与复苏后活力的关系分析 被引量：5
13
作者 郭海平 郭冠萍 郝鹏 《畜牧与饲料科学》 2010年第3期6-7,共2页
对BHK21细胞不同的冻存密度与细胞复苏后活力的关系进行了统计分析。首先取处于对数生长期的细胞,以4种不同的密度进行冻存,这4种密度分布在0.5×107～4.0×107个/mL之间。冻存2周后,每种密度各复苏3支,计算其活力,分析密度与... 对BHK21细胞不同的冻存密度与细胞复苏后活力的关系进行了统计分析。首先取处于对数生长期的细胞,以4种不同的密度进行冻存,这4种密度分布在0.5×107～4.0×107个/mL之间。冻存2周后,每种密度各复苏3支,计算其活力,分析密度与活力之间是否存在相关性。如此,平行做2次。结果发现,不同的细胞冻存密度与细胞复苏后的活力之间有相关性。 展开更多
关键词 bhk21细胞 冻存密度 活力
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悬浮培养型BHK-21细胞生长特性及成瘤性研究 被引量：3
14
作者 赵彩红 王美皓 +3 位作者 臧荣鑫 乔自林 马忠仁 王家敏 《西北民族大学学报（自然科学版）》 2019年第4期53-59,共7页
目的:了解低血清驯化的悬浮培养型BHK-21细胞的生长特性及致裸鼠成瘤能力.方法:比较研究悬浮型和贴壁型BHK-21细胞的细胞形态、生长动力学和成瘤性.结果:驯化的悬浮培养型和贴壁培养型BHK-21细胞生长状态均良好,最大增殖浓度分别为517&#... 目的:了解低血清驯化的悬浮培养型BHK-21细胞的生长特性及致裸鼠成瘤能力.方法:比较研究悬浮型和贴壁型BHK-21细胞的细胞形态、生长动力学和成瘤性.结果:驯化的悬浮培养型和贴壁培养型BHK-21细胞生长状态均良好,最大增殖浓度分别为517×10^4/mL和39.67×10^4/mL,群体倍增时间分别为23.03 h和21.36 h,能显著提高细胞培养密度(P<0.05).背部皮下接种致裸鼠成瘤性实验表明,驯化的悬浮培养型组裸鼠的体重增长率均低于贴壁培养型BHK-21细胞、阳性细胞组(Hela)和阴性细胞组(KMB17)(P>0.05),裸鼠成瘤体积增长率均高于其他三组(P<0.05).结论:驯化的悬浮培养型BHK-21细胞能显著提高细胞密度,其成瘤性方面还需进一步改善. 展开更多
关键词 驯化后悬浮培养型bhk-21细胞 贴壁培养型bhk-21细胞 生长特性 成瘤性
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BHK-21悬浮细胞流加培养的研究 被引量：5
15
作者 武发菊 刘萍 +6 位作者 安芳兰 董文教 宋玉霞 董金杰 牟克斌 王超英 刘学荣 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第6期150-153,共4页
试验旨在研究流加培养基中不同营养成分、初始接种密度、流加起始时间对BHK21悬浮细胞流加培养的影响。结果表明，流加浓缩包中的氨基酸对促进细胞生长有明显影响，而无血清培养基添加成分不仅促进细胞生长，且对细胞活力的维持起着较... 试验旨在研究流加培养基中不同营养成分、初始接种密度、流加起始时间对BHK21悬浮细胞流加培养的影响。结果表明，流加浓缩包中的氨基酸对促进细胞生长有明显影响，而无血清培养基添加成分不仅促进细胞生长，且对细胞活力的维持起着较为重要的作用。初始接种密度为3×10^5～6×10^5／mL，培养至48h开始流加一定量的浓缩液，流加培养效果较好。另外，在已优化的条件下进行流加培养，未出现细胞大量凋亡现象。 展开更多
关键词 bhk-21细胞 悬浮培养 流加培养 细胞凋亡
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狂犬病毒“北京株”在地鼠肾传代细胞中增殖的电镜观察 被引量：4
16
作者 李德忠 武晓华 解兵 《中国病毒学》 CSCD 1995年第2期125-130,共6页
用透射电子显微镜观察术，对狂犬病固定毒“北京株”在地鼠肾传代细胞（８ＨＫ＿（２１））中增殖的形态学变化进行了研究。在受感染的细胞中有大量子弹状和长杆状的病毒颗粒。大多数病毒在扩张的内质网膜上以出芽的方式发生，凸向内质... 用透射电子显微镜观察术，对狂犬病固定毒“北京株”在地鼠肾传代细胞（８ＨＫ＿（２１））中增殖的形态学变化进行了研究。在受感染的细胞中有大量子弹状和长杆状的病毒颗粒。大多数病毒在扩张的内质网膜上以出芽的方式发生，凸向内质网腔内并逐渐发育成子弹状和杆状的成熟病毒。含病毒的内质网周围常伴有颗粒状或丝状均质区域，少数病毒在细胞膜上芽生。细胞间隙中亦可见病毒。还见病毒在细胞核膜内、外层上芽生，核周间隙中有许多病毒，有的与核边缘染色质密切接触并使其缺损。细胞核有的肿胀，有的浓缩，有的核内有较多的染色质间颗粒和周颗粒，但均未见病毒颗粒。表明该病毒的发生发育对细胞的膜性系统有密切依赖性，同时该病毒对宿主细胞有破坏作用。 展开更多
关键词 狂犬病毒 bhk_(21)细胞 电镜观察
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无血清培养基悬浮培养BHK21细胞驯化的研究 被引量：4
17
作者 井莲娜 付智财 黄炯 《草食家畜》 2013年第3期51-56,共6页
本研究主要探索用常规BHK21贴壁细胞(F38)驯化为适应无血清培养基的全悬浮细胞的过程并使用生物反应器放大进行了相关研究。实验表明:常规BHK21细胞通过运用相应的商品化培养基进行低血清贴壁驯化、再到低血清全悬浮驯化、最后到无血清... 本研究主要探索用常规BHK21贴壁细胞(F38)驯化为适应无血清培养基的全悬浮细胞的过程并使用生物反应器放大进行了相关研究。实验表明:常规BHK21细胞通过运用相应的商品化培养基进行低血清贴壁驯化、再到低血清全悬浮驯化、最后到无血清全悬浮驯化,使细胞达到全悬浮的状态。经过四十代的传代后,细胞在无血清悬浮培养基中生长细胞数量可达3.0×106/mL以上,且形态较好,倍增时间稳定,活力在90%以上。实验中采用速降和缓降两种方法进行过渡驯化,结果表明,在贴壁状态下,细胞对缓降方式比速降方式适应性要好,细胞的形态较好,活力在90%以上。细胞从低血清悬浮到无血清悬浮过程中,两种过渡方式无明显差异,均经过了5～10代驯化,细胞就完全适应了无血清悬浮培养基。无血清悬浮细胞从液氮中复苏后,采用直线放大的形式从1.5 mL到250 mL再到5 L反应器最后到650 L反应器中生长。在培养参数方面进行了摸索,最终验证用直线放大的方法是可行的。细胞数量可达4.5×106/mL左右,细胞活力在90%以上,且细胞在放大过程中,形态良好,倍增时间稳定在18 h。 展开更多
关键词 无血清悬浮培养 bhk21 驯化
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蓝舌病病毒感染对BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素应答的影响
18
作者 罗世美 陈韵伊 +15 位作者 李其沙 周艳梅 王怡斐 廖芯玉 胡雪柔 魏远健 李梦琴 朱萌 张迅 陈贝蕊 马鲜平 谢佳芮 寇美玲 苗海生 李芳 易华山 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1639-1644,1690,共7页
蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的一种虫媒病毒,为研究蓝舌病病毒感染与宿主细胞干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。研究以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的BHK-21细胞通过实时荧光定量PCR分析... 蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的一种虫媒病毒,为研究蓝舌病病毒感染与宿主细胞干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。研究以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的BHK-21细胞通过实时荧光定量PCR分析干扰素通路基因mRNA表达特征,以及Western blot分析MDA5、TRAF3、RIG-Ⅰ和TBK1蛋白表达。结果表明,在诱导24 h时,干扰素信号通路基因表达的变化最为明显,IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ、TBK1、MDA5、VISA、TRAF3基因的mRNA表达水平呈上调表达,而IKKε、TRAF6基因的mRNA表达水平呈下调表达,在蛋白水平上MDA5、TBK1蛋白上调表达而RIG-Ⅰ、TRAF3蛋白下调表达,表明BTV感染诱导BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答,为进一步探究IFN-Ⅰ信号通路调控基因在BTV感染的宿主细胞抗病毒免疫机制研究奠定基础。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 天然免疫 Ⅰ型干扰素 bhk-21
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DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立 被引量：3
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作者 王宇 阎瑾琦 +2 位作者 张亮 王越 于继云 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期304-306,共3页
目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo... 目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以NotI和BamHI双酶切以及测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒以Lipo-fectamineTM2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达。结果双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明DC-SIGN基因与原序列一致。pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了稳定表达DC-SIGN分子的细胞系。流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%。免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面。Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带。结论成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 基因 DC-SIGN bhk21细胞系 树突细胞
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腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备 被引量：3
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作者 陆月 刘丹 +7 位作者 张孝任 刘雪荣 沈炜 郑刚 柳云帆 董小岩 吴小兵 高基民 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1239-1246,共8页
利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD（可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白）蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGF... 利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD（可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白）蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量（MOI）（0-1 000）感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI（0~1 000）感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学� 展开更多
关键词 腺病毒 重组蛋白 bhk21细胞 哺乳动物细胞 sTNFRII-gAD
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