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调节高致病力CA—MRSA α-毒素表达的基因筛选及功能研究 被引量：1
1
作者 李敏 胡锦辉 +3 位作者 李茹 张心菊 阮斐诒 吕元 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期680-685,共6页
目的 从CA-MILSA全基因组水平筛选出除域值感知（quorum sensing）基因系统以外对α-毒素表达有明显调节作用的基因,并研究其调节机制.方法 使用本实验室构建并已申请国家专利的真核转座酶为基础的转座系统构建CA-MKSA转座子,并随机插... 目的 从CA-MILSA全基因组水平筛选出除域值感知（quorum sensing）基因系统以外对α-毒素表达有明显调节作用的基因,并研究其调节机制.方法 使用本实验室构建并已申请国家专利的真核转座酶为基础的转座系统构建CA-MKSA转座子,并随机插入突变文库.通过用5%羊血平板筛选出与野生株相比溶血明显改变的克隆,接着用定量RT-PCR以及WB等实验筛选出α-毒素表达明显下降的突变菌株,运用随机引物反向PCB和测序等方法鉴定出突变基因.通过基因互补表达实验、小鼠菌血症与皮肤脓肿模型实验以及荧光定量RT-PCR等方法对目标基因以及其编码蛋白的功能进行研究.结果 在CA-MRSA中建立了一个库容量约为104个克隆的转座子随机插入突变库,最终筛选出25株α-毒素表达明显下降的突变菌株.CA-MRSA野生株溶血直径平均为212 mm,而其中AraC转录调节子突变株（AraC-）几乎无溶血,当将AraC基因互补回突变株（AraC-pT181araC）后,其溶血直径平均为197 mm,部分恢复到野生株溶血水平.荧光定量RT-PCR结果显示,与CA-MRSA野生株（PSMα为257.30±37.33,agr为115.60±0.81,α-毒素为3.23±0.21）相比,在AraC-中α-毒素、PSMα以及agr表达均明显下调（α-毒素1.09±0.01：t=10.18,P〈0.01;PSMα 34.85±2.15：t=5.95,P〈0.05;agr 35.19±1.72：t=42.33,P〈0.01）.小鼠菌血症模型实验结果为CA-MRSA野生株与AraC-（（x）±5）差异具有统计学意义（χ2=21.34,P〈0.01）.AraC-p1F181araC中PSMα、agr、α-毒素（hla）表达（分别为PSMα：180.10±15.29,agr：101.50±8.96,α-毒素：2.59±0.26）均部分恢复到野生株表达水平,与CA-MRSA野生株相比,差异无统计学意义（PSMα：t=1.914,P〉0.05;agr：t=1.563,P〉0.05;α-毒素：t=1.923,P〉0.05）.CIpP在MaC-（0.21±0.01）和AraC-pT181araC（0.17±0.03）中的表达与CA-MRSA野生株（0.20±0.01）相比,差异无统计学意义（t=0.555,P〉0.05和t=0.851,P〉0.05）.小鼠皮肤脓肿� 展开更多
关键词 甲氧西林抗药性 葡萄球菌 金黄色 arac转录因子 毒力因子类 细菌毒素类
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类鼻疽伯克霍尔德菌AraC转录因子基因的原核表达及纯化
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作者 曾慧 黄玮晨 +3 位作者 高洁 江昱颖 胡琪 修皓 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第7期761-765,共5页
目的从海南类鼻疽伯克霍尔德菌菌株BPHN001中克隆得到AraC转录因子基因,构建类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)AraC转录因子基因原核表达质粒,对该转录因子基因进行原核表达,并对表达产物进行纯化。方法根据AraC转录因子... 目的从海南类鼻疽伯克霍尔德菌菌株BPHN001中克隆得到AraC转录因子基因,构建类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)AraC转录因子基因原核表达质粒,对该转录因子基因进行原核表达,并对表达产物进行纯化。方法根据AraC转录因子基因设计特异性扩增引物,将PET-28a(+)质粒和扩增得到的AraC转录因子基因产物同时用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,构建带His标签的重组质粒。经测序验证后,将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),采用最佳浓度IPTG进行诱导,采用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。通过Ni^(2+)柱纯化目的蛋白,采用Western blot检测纯化蛋白的免疫反应性。结果特异性引物扩增得到的产物大小约为1000 bp,与目的基因片段1032 bp基本一致。将扩增产物与PET-28a(+)载体连接后测序,与预期完全一致。重组载体转化BL21(DE3)后用最适IPTG浓度(0.5 mmol/L)诱导过夜(约16 h),SDS-PAGE检测表达产物分子质量在40~55 ku之间,与预期相符。表达蛋白纯化后进行Western blot,能被相应抗体识别。结论成功克隆得到AraC转录因子基因,,构建的含AraC转录因子基因原核表达载体转化DE3后经IPTG诱导可表达出融合蛋白,经Ni^(2+)柱纯化得到具有免疫反应原性的AraC转录因子蛋白,为AraC转录因子的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 类鼻疽伯克霍尔德菌 arac转录因子 原核表达
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