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无细胞百白破联合疫苗腺苷酸环化酶毒素液质联用定量检测方法的建立和应用
1
作者 卫辰 吴燕 +3 位作者 蔡心怡 晁哲 王丽婵 马霄 《微生物学免疫学进展》 CAS 2022年第1期22-29,共8页
目的 建立不同工艺配方的无细胞百白破联合疫苗(diphtheria, tetanus and acellular Pertussis combined vaccine, DTaP)中腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin, ACT)的液质联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,... 目的 建立不同工艺配方的无细胞百白破联合疫苗(diphtheria, tetanus and acellular Pertussis combined vaccine, DTaP)中腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin, ACT)的液质联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)定量检测方法。方法 对百日咳疫苗精制液、原液、DTaP成品和ACT参考品进行酶解前处理,采用BioC18 (2.1 mm×150 mm, 3μm)为固定相,0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为35℃,多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)对特定离子对进行检测。以ACT参考品建立标准曲线,对样品中的ACT准确定量,并对方法进行验证及初步应用。结果 肽段ITGDAQANVLR特异性良好,在1.25~31.25μg/mL范围内线性良好(R^(2)>0.99),残差平方和为2.55,不同基质稀释标准曲线的残差平方和分别为3.08和1.32,基质效应较弱。DTaP成品回收率为80%~109%、原液回收率为93%~121%、精制液回收率为112%~120%;进样精密度为2.32%;中间精密度<20%,具备较好的准确性、精密度,且不同型号仪器的系统适用性研究结果一致。将该方法用于检测4个厂家的无细胞百白破联合疫苗多个工序段含有百日咳疫苗的样品,其中2个厂家的样品均有ACT检出,且ACT在共纯化阶段不断富集达100~250倍,另2个厂家产品仅在发酵液和盐析液中检出。结论 建立的LC-MS/MS检测方法准确性和精密度都比较好,基质效应弱,可用于DTaP中ACT的定量检测和工艺过程监测。 展开更多
关键词 无细胞百白破联合疫苗 腺苷酸环化酶毒素 质量控制 液相色谱串联质谱
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腺苷酸环化酶毒素的生物特性及其在百日咳疫苗中的潜在应用
2
作者 张学(综述) 江文文(审校) 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1516-1519,共4页
腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin,ACT)是百日咳杆菌分泌的重要毒力因子之一,可通过削弱吞噬细胞、中性粒细胞和T细胞等免疫细胞的杀菌能力来协助百日咳杆菌逃避宿主免疫系统的攻击。虽然ACT是一种具有腺苷酸环化酶活性和溶血... 腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin,ACT)是百日咳杆菌分泌的重要毒力因子之一,可通过削弱吞噬细胞、中性粒细胞和T细胞等免疫细胞的杀菌能力来协助百日咳杆菌逃避宿主免疫系统的攻击。虽然ACT是一种具有腺苷酸环化酶活性和溶血素活性的毒性蛋白,但可通过基因技术方法去除其毒力因素,成为无细胞百日咳(acel-l ular pertussis,aP)疫苗的一种潜在保护性抗原和佐剂。本文就ACT的生物特性及其在aP疫苗中的潜在应用作一综述。 展开更多
关键词 腺苷酸环化酶毒素 生物特性 百日咳疫苗 免疫原性 佐剂
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腺苷酸环化酶毒素在无细胞百日咳疫苗中的免疫保护效果评价
3
作者 张学 李婧妍 姬秋彦 《微生物学免疫学进展》 CAS 2021年第3期20-25,共6页
目的利用小鼠百日咳感染模型评估在无细胞百日咳疫苗中加入腺苷酸环化酶毒素的C端结构域(RTX_(751)),能否提升无细胞百日咳疫苗的免疫保护效果。方法 (1)用腺苷酸环化酶毒素的C端结构域与百日咳毒素(pertussis toxin, PT)、丝状血凝素(f... 目的利用小鼠百日咳感染模型评估在无细胞百日咳疫苗中加入腺苷酸环化酶毒素的C端结构域(RTX_(751)),能否提升无细胞百日咳疫苗的免疫保护效果。方法 (1)用腺苷酸环化酶毒素的C端结构域与百日咳毒素(pertussis toxin, PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin, FHA)、百日咳黏附素(pertussis adhesin, PRN)、氢氧化铝(aluminum hydroxide, Alum)佐剂制备成试验疫苗,对C57BL/6小鼠行腹腔两针免疫。(2)第2针免疫后21 d,用浓度为1×10^(11) CPU/mL的百日咳鲍特菌对小鼠进行气雾攻毒。攻毒后分别在3、7、14、28 d进行取样分析。(3)分析第2次免疫后IgG抗体水平和IgG1/IgG2a比例变化及感染百日咳鲍特菌后不同时间点呼吸道组织细菌载量和细胞因子IFN-γ、IL-17的变化。结果 1/40aP+RTX和1/80aP+RTX的IgG抗体水平高于1/40aP和1/80aP,差异有统计学意义(P<0.05),1/80aP+RTX的IgG2a/IgG1高于1/80 aP,差异有统计学意义(P<0.05);攻毒后14 d, 1/80aP+RTX组肺细菌菌落数最少、气管细菌已清除完毕,IFN-γ、IL-17细胞因子分泌量最低,与Alum组相比差异有统计学意义(P<0.05);Alum组与RTX_(751)组差异无统计学意义(P>0.05)。结论单独的RTX_(751)不能作为保护性抗原;但在小鼠模型中,RTX_(751)加入到无细胞百日咳疫苗可使免疫应答向Th1偏向去增强无细胞百日咳疫苗的免疫保护效果。 展开更多
关键词 腺苷酸环化酶毒素 免疫原性 佐剂 无细胞百日咳疫苗
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百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达
4
作者 石碧珠 张华捷 +1 位作者 孟民杰 张庶民 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第1期9-12,共4页
目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达... 目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 百日咳杆菌 腺苷酸环化酶毒素基因 克隆 表达
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