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C99引导淀粉样蛋白前体裂解过程的活体细胞研究
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作者 李晓睛 张苏明 +8 位作者 骆清铭 骆旻 张智红 邢变枝 杨华静 郭守刚 黎逢光 梁燕玲 常丽英 《中华神经医学杂志》 CAS CSCD 2008年第8期774-778,共5页
目的构建含有Swedish突变和Flemish突变的荧光真核表达系统，研究淀粉样蛋白前体（APP）酶解过程。方法通过聚合酶链式反应（PCR）得到编码Flemish突变的APP最后300个碱基片段（C99）、蓝色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白碱基序列（YFP... 目的构建含有Swedish突变和Flemish突变的荧光真核表达系统，研究淀粉样蛋白前体（APP）酶解过程。方法通过聚合酶链式反应（PCR）得到编码Flemish突变的APP最后300个碱基片段（C99）、蓝色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白碱基序列（YFP），生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段（54bp），利用基因工程技术将CFP、54bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3．0中．通过酶切、PCR、测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3．0-CFP-54bp—YFP—C99，并将其转染至人神经母细胞瘤细胞（SH—SY5Y）中．利用激光共聚焦显微镜观察荧光表达：检测荧光共振能量转移（FRET），以及进行β淀粉样蛋白（Aβ）免疫细胞化学染色。结果（1）基因序列分析证明重组质粒构建成功。（2）利用激光共聚焦显微镜观察转染细胞，发现融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光。（3）FRET检测发现CFP-54bp．YFP—C99可以发生β和γ裂解产生Aβ，沉积在细胞内、胞膜上以及细胞间隙；CFP-54bp—YFP不能发生β裂解。（4）免疫细胞化学染色证实Aβ在细胞膜、胞浆内以及细胞间隙聚集沉积。结论（1）重组质粒能够完成APP的有序裂解产生Aβ。（2）成功实现在活体细胞中观察APP裂解。（3）Aβ有可能产生于APP由胞浆至胞膜的运输过程中。（4）C99对于APP被裂解有重要意义．可能起到信号肽样的引导定位作用。 展开更多
关键词 荧光共振能量转移 C99 信号肽 app转运 AΒ
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