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表达人ABOA1.01等位基因的K562细胞稳定株的构建
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作者 邹敏 陈鸿天 +5 位作者 刘紫葳 赵晖 孔文兵 吕飘 刘持翔 周华友 《中国输血杂志》 CAS 2018年第12期1362-1367,共6页
目的构建稳定表达人ABO~*A1.01等位基因的K562细胞株。方法在载体GV492(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)基础上构建ABO~*A1.01等位基因蛋白质编码区(coding sequence,CDS)全长重组质粒GV492-A,将慢病毒重组载体、2种慢病毒包... 目的构建稳定表达人ABO~*A1.01等位基因的K562细胞株。方法在载体GV492(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)基础上构建ABO~*A1.01等位基因蛋白质编码区(coding sequence,CDS)全长重组质粒GV492-A,将慢病毒重组载体、2种慢病毒包装载体pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞做病毒包装;将重组慢病毒感染人慢性髓细胞白血病K562细胞,用嘌呤霉素筛选得到K562-A稳定株,荧光显微镜下观察K562-A稳定株;qPCR检测K562-A稳定株中ABO等位基因mRNA表达水平;对稳定株中的ABO等位基因测序;用流式细胞术检测稳定株细胞表面A抗原的表达情况。结果重组载体测序结果证实成功构建了ABO~*A1.01等位基因重组表达载体;包装慢病毒的滴度适中:ABO~*A1.01等位基因重组慢病毒为1.5E+9 TU/mL,载体GV492对照慢病毒为5.0E+8 TU/mL,说明重组慢病毒包装成功。重组慢病毒载体感染K562细胞后,得到稳定感染细胞株。K562-A稳定株的qPCR检测显示ABO等位基因的mRNA表达水平明显升高(P<0.01),GFP荧光蛋白阳性率>98%,ABO等位基因测序证实ABO~*A1.01等位基因在细胞内成功转录,流式检测显示细胞表面表达A抗原。结论成功构建表达ABO~*A1.01等位基因的K562-A细胞稳定株,细胞表面表达A抗原。 展开更多
关键词 K562细胞 abo~*A1.01等位基因 慢病毒载体 A抗原
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