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腺嘌呤碱基编辑器ABE8e多聚体的形成机制研究及抑制策略
1
作者
周项
朱海霞
黄强
《工业微生物》
CAS
2022年第6期1-9,共9页
研究腺嘌呤碱基编辑器ABE8e(以下简称ABE8e)多聚化的成因,降低其多聚体的比例,为ABE8e的制备提供技术支持。首先,运用分子建模软件分析ABE8e的三维结构,了解多聚体的成因,在此基础上构建了相应的突变体ABE8e-T,并对其进行纯化,验证理论...
研究腺嘌呤碱基编辑器ABE8e(以下简称ABE8e)多聚化的成因,降低其多聚体的比例,为ABE8e的制备提供技术支持。首先,运用分子建模软件分析ABE8e的三维结构,了解多聚体的成因,在此基础上构建了相应的突变体ABE8e-T,并对其进行纯化,验证理论分析的正确性。在确认聚集原因后,为了降低ABE8e多聚体的比例,针对性地优化了ABE8e的缓冲体系。在结构信息的指导下,发现ABE8e二聚化界面中疏水区域的曝露导致了分子间聚集。突变体ABE8e-T(R64L/R74E)的纯化结果显示,二聚化界面进一步打开后,多聚体比例增多。缓冲体系优化结果表明,在现有缓冲体系中添加0.5 mol/L精氨酸,能中和分子表面的疏水性,从而降低了ABE8e的多聚体比例。结论:在ABE8e未形成二聚体的情况下,曝露了二聚化界面的疏水性区域,导致其分子间聚集,形成了多聚体。通过在缓冲液中添加精氨酸可以减弱分子间疏水作用,降低了多聚体的比例。因此,基于结构的分析方法可以精准地分析多聚体的成因,加速了下游工艺的开发,优化后的缓冲体系可为ABE8e的纯化和制备提供有用技术支持。
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关键词
蛋白质纯化
腺嘌呤碱基编辑器
abe
8
e
多聚体去除
下载PDF
职称材料
优化近乎PAM-less腺嘌呤碱基编辑器提升编辑效率
2
作者
周小钰
王晓月
《基础医学与临床》
2022年第6期902-907,共6页
目的探究替换近乎PAM-less腺嘌呤碱基编辑器(ABE)不同元件对其编辑效率的影响。方法在SpRY-ABEmax中,以Tad-8e替换ABEmax构建SpRY-ABE8e,在此基础上将Cas9蛋白变体SpRY与Tad-8e之间的连接肽3xGGS-XTEN-3xGGS改为长度缩短的PAPAPA连接肽...
目的探究替换近乎PAM-less腺嘌呤碱基编辑器(ABE)不同元件对其编辑效率的影响。方法在SpRY-ABEmax中,以Tad-8e替换ABEmax构建SpRY-ABE8e,在此基础上将Cas9蛋白变体SpRY与Tad-8e之间的连接肽3xGGS-XTEN-3xGGS改为长度缩短的PAPAPA连接肽。将ABEs和sgRNA表达质粒共转染人胚肾细胞HEK 293T,24 h后加入1.5μg/mL嘌呤霉素并于72 h后通过流式分选表达绿色荧光蛋白的细胞,提取细胞基因组并使用PCR扩增技术在预期产生编辑的位点进行扩增,采用Sanger测序并使用Beat工具预估各个位点编辑效率情况。结果与对照组SpRY-ABEmax相比,SpRY-ABE8e编辑效率提升,编辑窗口也扩大(P<0.05);通过使用长度缩短的连接肽可以在保持编辑效率提升的同时限制SpRY-ABE8e的编辑窗口。结论可通过替换PAM-less ABE不同元件来提升编辑效率,这将为今后基因治疗提供更多的工具选择。
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关键词
腺嘌呤碱基编辑器
SpRY
abe
8
e
编辑效率
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职称材料
题名
腺嘌呤碱基编辑器ABE8e多聚体的形成机制研究及抑制策略
1
作者
周项
朱海霞
黄强
机构
复旦大学生命科学学院
出处
《工业微生物》
CAS
2022年第6期1-9,共9页
文摘
研究腺嘌呤碱基编辑器ABE8e(以下简称ABE8e)多聚化的成因,降低其多聚体的比例,为ABE8e的制备提供技术支持。首先,运用分子建模软件分析ABE8e的三维结构,了解多聚体的成因,在此基础上构建了相应的突变体ABE8e-T,并对其进行纯化,验证理论分析的正确性。在确认聚集原因后,为了降低ABE8e多聚体的比例,针对性地优化了ABE8e的缓冲体系。在结构信息的指导下,发现ABE8e二聚化界面中疏水区域的曝露导致了分子间聚集。突变体ABE8e-T(R64L/R74E)的纯化结果显示,二聚化界面进一步打开后,多聚体比例增多。缓冲体系优化结果表明,在现有缓冲体系中添加0.5 mol/L精氨酸,能中和分子表面的疏水性,从而降低了ABE8e的多聚体比例。结论:在ABE8e未形成二聚体的情况下,曝露了二聚化界面的疏水性区域,导致其分子间聚集,形成了多聚体。通过在缓冲液中添加精氨酸可以减弱分子间疏水作用,降低了多聚体的比例。因此,基于结构的分析方法可以精准地分析多聚体的成因,加速了下游工艺的开发,优化后的缓冲体系可为ABE8e的纯化和制备提供有用技术支持。
关键词
蛋白质纯化
腺嘌呤碱基编辑器
abe
8
e
多聚体去除
Keywords
prot
e
in purification
ad
e
nin
e
bas
e
e
ditor
abe
8
e
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e
moval of aggr
e
gation
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
优化近乎PAM-less腺嘌呤碱基编辑器提升编辑效率
2
作者
周小钰
王晓月
机构
中国医学科学院基础医学研究所
出处
《基础医学与临床》
2022年第6期902-907,共6页
基金
国家自然科学基金(32070603)。
文摘
目的探究替换近乎PAM-less腺嘌呤碱基编辑器(ABE)不同元件对其编辑效率的影响。方法在SpRY-ABEmax中,以Tad-8e替换ABEmax构建SpRY-ABE8e,在此基础上将Cas9蛋白变体SpRY与Tad-8e之间的连接肽3xGGS-XTEN-3xGGS改为长度缩短的PAPAPA连接肽。将ABEs和sgRNA表达质粒共转染人胚肾细胞HEK 293T,24 h后加入1.5μg/mL嘌呤霉素并于72 h后通过流式分选表达绿色荧光蛋白的细胞,提取细胞基因组并使用PCR扩增技术在预期产生编辑的位点进行扩增,采用Sanger测序并使用Beat工具预估各个位点编辑效率情况。结果与对照组SpRY-ABEmax相比,SpRY-ABE8e编辑效率提升,编辑窗口也扩大(P<0.05);通过使用长度缩短的连接肽可以在保持编辑效率提升的同时限制SpRY-ABE8e的编辑窗口。结论可通过替换PAM-less ABE不同元件来提升编辑效率,这将为今后基因治疗提供更多的工具选择。
关键词
腺嘌呤碱基编辑器
SpRY
abe
8
e
编辑效率
Keywords
ad
e
nin
e
bas
e
e
ditor
SpRY
abe
8
e
e
diting
e
ffici
e
ncy
分类号
Q74 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
腺嘌呤碱基编辑器ABE8e多聚体的形成机制研究及抑制策略
周项
朱海霞
黄强
《工业微生物》
CAS
2022
0
下载PDF
职称材料
2
优化近乎PAM-less腺嘌呤碱基编辑器提升编辑效率
周小钰
王晓月
《基础医学与临床》
2022
0
下载PDF
职称材料
已选择
0
条
导出题录
引用分析
参考文献
引证文献
统计分析
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