AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达 被引量：7

1

作者 马鑫 鲁晓春 +6 位作者 彭建强 谭淑萍 袁振华 尹芳 王宏 吴小兵 侯云德 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期253-255,共3页

目的　构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK 2 1细胞中抑制荧光素酶的表达。方法　从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6snRNA启动子 ,接以被 9bp序列间隔的 2 1bp荧光素酶靶序列的反向重复序列 ,置于AAV载体质粒pSNAV中 ,构建成荧光素酶短... 目的　构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK 2 1细胞中抑制荧光素酶的表达。方法　从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6snRNA启动子 ,接以被 9bp序列间隔的 2 1bp荧光素酶靶序列的反向重复序列 ,置于AAV载体质粒pSNAV中 ,构建成荧光素酶短发夹环RNA(shRNA)产生质粒pSNAV U6 Luc。与pMAMneoLuc质粒共转染BHK 2 1细胞 ,检测其对荧光素酶表达的影响。并且单独转染荧光素酶细胞株 ,检测其抑制荧光素酶表达的效果。结果　pSNAV U6 Luc对共转染的pMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制 5 0 % ,而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制 70 %。结论　实验表明荧光素酶shRNA产生质粒能够有效抑制荧光素酶在BHK 2 1细胞中的表达。 展开更多

关键词 aav载体 质粒介导 荧光素酶 短发夹环RNA 哺乳动物 基因表达

原文传递

AAV-CRISPR/Cas9介导的血友病A基因治疗研究进展

2

作者 房帅 王刚 杨林花 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期1890-1893,共4页

血友病A是一种由凝血因子Ⅷ突变引起的X-连锁隐性出血性疾病。目前主要以外源凝血因子替代治疗为主。随着基因治疗的不断发展,为血友病A的治疗提供了新的研究方向。应用CRISPR-Cas9技术选择合适的靶位点,并通过相应的载体介导外源性B结... 血友病A是一种由凝血因子Ⅷ突变引起的X-连锁隐性出血性疾病。目前主要以外源凝血因子替代治疗为主。随着基因治疗的不断发展,为血友病A的治疗提供了新的研究方向。应用CRISPR-Cas9技术选择合适的靶位点,并通过相应的载体介导外源性B结构域删除的FⅧ变异体基因定向敲入和高效表达,达到治疗血友病A的目的。CRISPR-Cas9技术作为一种新兴的基因编辑工具,具有极大的高效性、安全性和有效性,已广泛用于血友病基因治疗研究。本文就现阶段血友病A基因治疗的载体选择、治疗基因的构建、基因编辑技术及表达靶位的选择进行综述。 展开更多

关键词 血友病A CRISPR-Cas9 基因治疗 aav载体 表达靶位

下载PDF 职称材料

AAV载体基因药物临床生物样本分析要点及挑战

3

作者 余双庆 吴小兵 《中国医药导刊》 2023年第7期669-676,共8页

细胞和基因治疗已进入高速发展期,多种病毒和非病毒载体被应用于细胞和基因治疗领域。其中,腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体因其对治疗基因的高效转导率、持久的表达能力和良好的安全性等特点,在遗传病的体内基因治疗领域... 细胞和基因治疗已进入高速发展期,多种病毒和非病毒载体被应用于细胞和基因治疗领域。其中,腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体因其对治疗基因的高效转导率、持久的表达能力和良好的安全性等特点,在遗传病的体内基因治疗领域得到广泛应用。随着越来越多的AAV载体基因药物进入临床研究阶段,AAV载体药物的生物分析也越来越受关注,涉及药物代谢动力学(pharmacokinetics, PK)、药效学(pharmacodynamics, PD)、免疫原性、病毒脱落和基因整合监测等方面,目前均缺乏标准化的分析方法、标准品和对照品,在分析方法验证方案、接受标准等方面亦尚无统一规定。囿于AAV载体药物组成和作用机制的复杂性,无论是分析方法、结果解释,还是监管机构的建议和要求等方面均不同于传统小分子和蛋白药物。本研究结合AAV载体基因药物特点、监管机构建议和已发表的临床研究,概述AAV载体基因药物临床生物样本给药前、给药后分析工作要点及面临的挑战,以期为临床上AAV载体基因治疗药物的研究开发提供借鉴和参考。 展开更多

关键词 aav载体 基因治疗 生物分析 临床试验

下载PDF 职称材料

神经肌肉疾病基因治疗的研究进展

4

作者 周鹏 颜景斌 《生命的化学》 CAS 2022年第5期968-975,共8页

神经肌肉疾病(neuromuscular diseases,NMD)是一类以运动单位受损、运动耐力下降、肌力减退为主要表现的中枢及周围神经疾病。长期以来,神经肌肉疾病的治疗手段主要是对症治疗,但仅能缓解症状,无法根治。腺相关病毒(adeno-associated vi... 神经肌肉疾病(neuromuscular diseases,NMD)是一类以运动单位受损、运动耐力下降、肌力减退为主要表现的中枢及周围神经疾病。长期以来,神经肌肉疾病的治疗手段主要是对症治疗,但仅能缓解症状,无法根治。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体是经过基因工程改造过的转基因载体,由于其安全性好、免疫原性低、表达时间长,可以感染分裂细胞和非分裂细胞等特点,在基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。CRISPR/Cas9基因编辑系统由型CRISPR细菌免疫系统改进而来,具有靶向精确、脱靶率低、细胞毒性低等特点,是目前应用最为广泛的基因编辑工具。本综述总结了几种常见神经肌肉疾病的最新基因治疗进展,着重讨论了基于AAV载体和CRISPR/Cas9系统的基因治疗在NMD治疗中的潜在价值以及相应的风险。 展开更多

关键词 神经肌肉疾病 基因治疗 aav载体 CRISPR/Cas9

原文传递

腺相关病毒载体介导造血干细胞基因转导的策略 被引量：1

5

作者 赵卫红 吴剑卿 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期516-517,共2页

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）已被广泛用作基因治疗的载体。本文就提高AAV载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下。1自身互补的AAV载体由单链基因组向有转录活性的双链形式的转变障碍限制了AAV载体介导的基因转导。... 腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）已被广泛用作基因治疗的载体。本文就提高AAV载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下。1自身互补的AAV载体由单链基因组向有转录活性的双链形式的转变障碍限制了AAV载体介导的基因转导。自身互补双链DNA的AAV载体（scAAV）不需进行病毒DNA第二链的合成，大大提高了 AAV的转导效率。 展开更多

关键词 基因转导效率 病毒载体介导 造血干细胞 aav载体 双链DNA 腺相关病毒 病毒DNA 基因治疗

原文传递

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达 被引量：1

6

作者 张娟 林仲秋 +3 位作者 彭永排 张丙忠 周晖 杨清元 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期480-483,共4页

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅... 目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。 展开更多

关键词 人乳头状瘤病毒16型 重组腺相关病毒载体 真核细胞 mRNA HPV16E7基因 HEK293细胞 RT-PCR技术 斑点杂交法 aav载体 反向重复序列 病毒颗粒 病毒滴度 蛋白印迹法 重组质粒 鉴定结果 细胞内 验证 细胞系 胚胎肾 p基因 rep

原文传递

AAV诱导可耐受供肝方法学的实验研究 被引量：1

7

作者 邰升 苏志雷 +4 位作者 包少瑜 孙士波 迟强 吴德全 韩德恩 《中华肝胆外科杂志》 CAS CSCD 2007年第4期280-282,共3页

rAAV载体是许多肝脏疾病的有效基因治疗载体，目前的临床学研究和临床研究多应用rAAV-2载体亚型。最近报道，5×10^12vg／kg的rAAV-2转染肝脏可以用来治疗血友病、肝糖原储积征、癌症等。然而，当高滴度的载体通过肝脏门静脉和肝动... rAAV载体是许多肝脏疾病的有效基因治疗载体，目前的临床学研究和临床研究多应用rAAV-2载体亚型。最近报道，5×10^12vg／kg的rAAV-2转染肝脏可以用来治疗血友病、肝糖原储积征、癌症等。然而，当高滴度的载体通过肝脏门静脉和肝动脉灌注后，仅有相对小部分的肝细胞稳定转染，肝细胞稳定表达的比例为5％～10％， 展开更多

关键词 aav载体 实验研究 基因治疗载体 方法学 供肝 耐受 肝脏疾病 肝动脉灌注

原文传递

肝糖原积累病1例并文献复习

8

作者 任丽艳 《中文科技期刊数据库（引文版）医药卫生》 2022年第5期73-76,共4页

肝糖原积累病(GSD)是一种常染色体隐性遗传性糖代谢障碍疾病,根据酶的缺陷不同和疾病发现时间早晚,糖原积累病主要分为13型,其中I型最为常见。临床上主要表现包括肝肿大、低血糖、乳酸血症、高脂血症、高尿酸血症和生长迟缓等。目前糖... 肝糖原积累病(GSD)是一种常染色体隐性遗传性糖代谢障碍疾病,根据酶的缺陷不同和疾病发现时间早晚,糖原积累病主要分为13型,其中I型最为常见。临床上主要表现包括肝肿大、低血糖、乳酸血症、高脂血症、高尿酸血症和生长迟缓等。目前糖原积累病I型(GSD I)的诊断主要基于临床表现、生化异常、分子遗传学异常以及肝细胞活检等检查手段。目前肝糖原积累病的治疗仍以预防并减少低血糖发生为主,通过AAV载体介导基因方法亦被开发用于GSD Ia的治疗,平稳降糖,严格控制碳水化合物的摄入量可以延缓GSD Ia的并发症。 展开更多

关键词 肝糖原积累病 低血糖 aav载体

下载PDF 职称材料

腺相关病毒载体及其介导的自杀基因疗法

9

作者 曾赵军 《国外医学（肿瘤学分册）》 2001年第6期429-432,共4页

自杀基因疗法是肿瘤治疗的方法之一。腺相关病毒 (AAV)载体介导的自杀基因疗法尤其备受关注。通过对AAV载体的选择改建 ,调控外源基因的有效表达 ,提高基因转染的效率 ,充分发挥自杀基因的杀伤作用及旁观者效应来达到治疗肿瘤的目的。... 自杀基因疗法是肿瘤治疗的方法之一。腺相关病毒 (AAV)载体介导的自杀基因疗法尤其备受关注。通过对AAV载体的选择改建 ,调控外源基因的有效表达 ,提高基因转染的效率 ,充分发挥自杀基因的杀伤作用及旁观者效应来达到治疗肿瘤的目的。本文就 展开更多

关键词 自杀基因 腺相关病毒载体 aav载体 基因治疗 肿瘤

下载PDF 职称材料

低氧启动重组腺相关病毒的构建

10

作者 李桂林 王任直 +4 位作者 王欣 栗世方 窦万臣 张波 孔燕国 《中华神经医学杂志》 CAS CSCD 2005年第3期221-224,共4页

目的构建低氧启动rAAV,介导目的基因仅在低氧时特异性高效表达。方法通过分子生物学的方法,分别构建pGL3-6 HRE-CMV-mp和pGL3-6 HRE-CMV-mp-WPRE载体,比较2种低氧启动子的特异性和在低氧时的启动能力。选择最佳的低氧启动子构建低氧启动... 目的构建低氧启动rAAV,介导目的基因仅在低氧时特异性高效表达。方法通过分子生物学的方法,分别构建pGL3-6 HRE-CMV-mp和pGL3-6 HRE-CMV-mp-WPRE载体,比较2种低氧启动子的特异性和在低氧时的启动能力。选择最佳的低氧启动子构建低氧启动rAAV载体。采用磷酸钙和氯仿-PEG8000/NaCl-氯仿法构建低氧启动rAAV病毒。rAAV病毒蛋白电泳和EGFP报告基因验证低氧启动rAAV病毒的构建和介导目的基因在低氧时的表达。结果HRE-CMV-mp- WPRE是最佳的低氧启动子,在低氧时高效、特异的表达目的基因。低氧启动rAAV仅在低氧时介导报告基因EGFP的表达。采用6 HRE-CMV-mp-WPRE启动子的rAAV具有良好的低氧特异性和高效启动能力。结论采用最佳的低氧启动子,本研究实现了低氧启动rAAV的构建。 展开更多

关键词 重组腺相关病毒 低氧 GFP报告基因 Raav 目的基因 分子生物学 aav载体 启动子 特异性 高效表达 蛋白电泳 EGFP 动能力 介导 氯仿法 磷酸钙 最佳

原文传递

腺相关病毒介导带基因座控制区核心序列的β-珠蛋白基因在红系细胞中整合与表达

11

作者 李斌 刘德培 +4 位作者 王晶 董文吉 郭志晨 夏薇 梁植权 《自然科学进展（国家重点实验室通讯）》 2000年第4期320-324,共5页

为提高人β-珠蛋白基因在基因转移中的稳定性与在红系细胞中的表达水平,构建了带单个和多个基因座控制区核心序列的人β-珠蛋白基因腺相关病毒(ade-no-associated virus,AAV)载体AV53HS2Δβ2Neo和AV53HS432ΔβNeo。利用AAV载体介导的... 为提高人β-珠蛋白基因在基因转移中的稳定性与在红系细胞中的表达水平,构建了带单个和多个基因座控制区核心序列的人β-珠蛋白基因腺相关病毒(ade-no-associated virus,AAV)载体AV53HS2Δβ2Neo和AV53HS432ΔβNeo。利用AAV载体介导的基因转移将两种重组体导入红系细胞(MEL),分析了它们在MEL细胞中的整合与表达。结果表明,AAV载体介导带多个基因座控制区核心序列的人β-珠蛋白基因在MEL细胞中较稳定整合,呈现与内源α-珠蛋白基因可比的表达水平。 展开更多

关键词 Β-珠蛋白基因 基因座控制区 MEL aav载体

下载PDF 职称材料

一组可提供AAV载体复制和包装功能的重组HSV-1 被引量：5

12

作者 伍志坚 吴小兵 侯云德 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期74-76,共3页

目的　构建一组具有AAV载体复制和包装功能的重组HSV 1,从中选出功能较强者用于重组AAV的生产。方法　采用一套含有HSV 1基因组的粘粒系统构建重组HSV 1。首先将 2型腺病毒伴随病毒 (AAV 2 )rep基因的起始密码子ATG人工定点突变成ACG ;... 目的　构建一组具有AAV载体复制和包装功能的重组HSV 1,从中选出功能较强者用于重组AAV的生产。方法　采用一套含有HSV 1基因组的粘粒系统构建重组HSV 1。首先将 2型腺病毒伴随病毒 (AAV 2 )rep基因的起始密码子ATG人工定点突变成ACG ;然后将自身启动子控制下的AAV 2rep(起始密码子突变或未突变 )和cap基因分别插入粘粒上HSV 1的UL2基因或UL44基因 ,构建成重组粘粒cos6 rmc ΔUL2、cos5 6 rc ΔUL44cos5 6 rmc ΔUL44 ;将重组粘粒上的HSV 1片段分别与HSV 1的其余片段进行同源重组 ,得到 3株重组HSV 1。连同过去报道的一株重组HSV 1一起 ,分别命名为HSV1 rc ΔUL2、HSV1 rmc ΔUL2、HSV1 rc ΔUL44、HSV1 rmc ΔUL44。结果　 4株重组HSV 1经PCR鉴定均含有rep基因 ,分别感染携带绿色荧光蛋白 (GFP)基因的AAV载体细胞株后均能产生重组AAV。重组AAV可在BHK 2 1细胞中表达GFP。HSV1 rc ΔUL2和HSV1 rmc ΔUL2对AAV载体的包装能力明显强于HSV1 rc ΔUL44和HSV1 rmc ΔUL44。结论　构建的 4株重组HSV 1均具有复制和包装重组AAV的能力。其中HSV1 rc ΔUL2和HSV1 rmc ΔUL2功能较强 。 展开更多

关键词 遗传重组 腺病毒科 人疱疹病毒 aav载体复制 包装功能

原文传递

以HSV-1扩增子载体构建的新型重组AAV载体包装系统 被引量：4

13

作者 舒跃龙 吴小兵 +3 位作者 杨天忠 贡惠宇 侯云德 颜子颖 《中国科学（C辑）》 CSCD 1998年第5期457-462,共6页

将缺失两端ITR的AAV 2基因组克隆于HSV 1扩增子载体获得了质粒pHSV AAV .以HSV 1tsK株为辅助病毒感染转染了该质粒的Vero细胞 ,可获得一种具有包装重组AAV质粒能力的混合毒种 .连续传代可使其包装能力迅速升高 ,至 5～ 6代达到最高并趋... 将缺失两端ITR的AAV 2基因组克隆于HSV 1扩增子载体获得了质粒pHSV AAV .以HSV 1tsK株为辅助病毒感染转染了该质粒的Vero细胞 ,可获得一种具有包装重组AAV质粒能力的混合毒种 .连续传代可使其包装能力迅速升高 ,至 5～ 6代达到最高并趋于平稳 .此混合毒种中 ,含有包装了多拷贝AAV 2基因组的复制缺陷性假型HSV 1病毒 ,它可表达AAV 2编码的复制与包装所需的各种反式蛋白 ;同时也含有HSV 1tsK病毒 ,它提供AAV 2复制与包装所需的全部辅助病毒功能 .实验结果也表明 ,HSV 1tsK病毒的复制为混合毒种辅助重组AAV载体的包装所必需 .这项研究首次报道了一种全新的重组AAV载体包装系统 ,与传统的双质粒共转染、腺病毒辅助包装方案相比 ,本系统简便易行 ,并明显提高了重组AAV的包装效率 . 展开更多

关键词 重组aav载体 HSV-1 扩增子载体 包装系统 aav

原文传递

以EBV复制子载体为基础的新型重组AAV载体包装系统 被引量：2

14

作者 颜子颖 姚二梅 +2 位作者 张桐 舒跃龙 侯云德 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 1997年第17期1860-1863,共4页

重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不... 重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒. 展开更多

关键词 重组aav载体 EBV复制子载体 包装细胞系 腺病毒

原文传递

双链AAV载体的构建及其转导效率的检测

15

作者 吴剑卿 赵卫红 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1348-1348,共1页

基因治疗为人类多种疾病的治疗带来了希望．但其临床应用的道路曲折．问题在于安全和有效的基因输送系统的开发。如何将治疗基因特异、有效地传递给靶细胞，这是基因治疗中的关键。腺相关病毒（AAV）已被广泛用作基因治疗的载体。由于... 基因治疗为人类多种疾病的治疗带来了希望．但其临床应用的道路曲折．问题在于安全和有效的基因输送系统的开发。如何将治疗基因特异、有效地传递给靶细胞，这是基因治疗中的关键。腺相关病毒（AAV）已被广泛用作基因治疗的载体。由于其安全性和低免疫反应性而受到人们的青睐，目前尚未见AAV与恶性疾病明确有关的报道。AAV为单链DNA病毒，由单链基因组向有转录活性的双链形式的转变限制了AAV载体介导的基因转导。自身互补双链DNA的腺相关病毒（scAAV）载体绕开了病毒DNA第二条链合成这一限速步骤，能显著提高AAV的转导效率。本研究率先在国内进行scAAV的构建和包装．并检测其转导效率。 展开更多

关键词 aav载体 双链DNA 基因转导 检测 单链DNA病毒 基因治疗 腺相关病毒 恶性疾病

下载PDF 职称材料

低氧诱导神经元特异性表达bFGF重组腺相关病毒载体构建研究

16

作者 钱周敏 《亚太传统医药》 2015年第6期5-6,共2页

目的:研究构建低氧诱导神经元特异性表达碱性纤维细胞生长因子(bFGF)重组腺相关病毒载体。方法:以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为治疗靶基因,通过分子克隆手段,构建低氧诱导、神经元特异性表达bFGF的"时空"表达可调控性新型... 目的:研究构建低氧诱导神经元特异性表达碱性纤维细胞生长因子(bFGF)重组腺相关病毒载体。方法:以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为治疗靶基因,通过分子克隆手段,构建低氧诱导、神经元特异性表达bFGF的"时空"表达可调控性新型重组腺相关病毒(AAV)载体。结果:将重组质粒5HRE-3NRSE-bFGF的菌液送测序,得到测序结果,并与合成的DNA寡核苷酸序列进行比较,证实与设计序列完全一致。结论:构建、包装重组腺相关病毒载体pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF有效。 展开更多

关键词 青光眼 低氧诱导 神经元特异性 腺相关病毒(aav)载体

下载PDF 职称材料