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CPC酰化酶基因的人工合成与重组表达 被引量：8
1
作者 安明 于慧敏 +2 位作者 罗晖 宋文斯 沈忠耀 《清华大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1499-1503,共5页
7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是头孢菌素类抗生素的中间体,在医药工业中具有重要的应用价值。该文通过人工设计、合成并在重组大肠杆菌中表达头孢菌素C(CPC)酰化酶基因来实现7-ACA的一步酶法催化合成。以Pseudomonassp.SE83菌株的CPC酰化酶蛋... 7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是头孢菌素类抗生素的中间体,在医药工业中具有重要的应用价值。该文通过人工设计、合成并在重组大肠杆菌中表达头孢菌素C(CPC)酰化酶基因来实现7-ACA的一步酶法催化合成。以Pseudomonassp.SE83菌株的CPC酰化酶蛋白质序列为模板,对CPC酰化酶基因分两段进行了全局优化设计,包括密码子替换、鸟嘌呤和胞嘧啶含量调整以及酶切位点修改等。通过装配聚合酶链式反应方法最终获得了目标基因,并克隆至表达载体pET-28a,成功构建了诱导型重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28-acy。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,在Luria-Bertani培养基中,新建重组大肠杆菌所表达的可溶CPC酰化酶占菌体总蛋白的75%以上;经优化培养基摇瓶发酵,重组菌的CPC酰化酶酶活高达2956U/L。采用上述方法获得的CPC酰化酶,在一步酶法合成7-ACA的工业化生产中具有广阔的应用前景。 展开更多
关键词 7-氨基头孢烷酸 头孢菌素C酰化酶 重组大肠杆菌 基因合成 装配聚合酶链式反应 高表达
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酶形式差异的三酶系统一步法转化头孢菌素C制备7-氨基头孢烷酸
2
作者 邱杰 刘玉婷 +3 位作者 陈钰泉 廖威 袁晶 谭强 《广西科学》 CAS 2018年第4期438-443,共6页
【目的】对酶形式差异的三酶系统一步法裂解头孢菌素C(CPC)制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)进行研究。【方法】对重组大肠杆菌分别进行摇瓶和发酵罐高密度表达,获得最高酶活后使用两个形式差异的三酶系统一步法转化CPC制备7-ACA。【结果】相... 【目的】对酶形式差异的三酶系统一步法裂解头孢菌素C(CPC)制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)进行研究。【方法】对重组大肠杆菌分别进行摇瓶和发酵罐高密度表达,获得最高酶活后使用两个形式差异的三酶系统一步法转化CPC制备7-ACA。【结果】相较于摇瓶发酵,发酵罐发酵获得的酶活更高,发酵罐上对重组大肠杆菌的高密度表达发现,补料流加总量为400mL的甘油混合液(15%甘油+7.5%鱼蛋白胨,W/V),发酵72h后菌浓度达到32.79g/L、最高的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GA)和过氧化氢酶(CAT)活力分别为7 099.85U/L和15 776.20U/L。利用一个三酶系统包括固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)、游离GA和CAT,一步法催化CPC获得的7-ACA生成率为87.28%;而另一个三酶系统包括固定化DAAO、冻融细胞GA和CAT一步法催化CPC获得的7-ACA生成率为87.10%。【结论】两种酶形式差异的三酶系统一步法制备7-ACA的得率大致相等。GA对α?酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(AKA-7-ACA)的特异性和水解能力较差,限制了该工艺运用。 展开更多
关键词 三酶系统 D-氨基酸氧化酶 戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶 过氧化氢酶 7-氨基头孢烷酸
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