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单增李斯特菌Lm 4 b_02324基因缺失株的构建及生物特性研究
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作者 曾东东 刘彩霞 +6 位作者 寇丽君 秦赫 晋瑞婕 王静 任静静 马勋 蒋建军 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1981-1990,共10页
【目的】研究Lm 4 b_02324基因编码的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶对单增李斯特菌生物学特性的影响,为研究单增李斯特菌的致病机制奠定基础。【方法】本研究使用重叠延伸PCR技术,并通过连续传代来构建稳定遗传野生型单增李斯特菌Lm 928株的Lm 4... 【目的】研究Lm 4 b_02324基因编码的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶对单增李斯特菌生物学特性的影响,为研究单增李斯特菌的致病机制奠定基础。【方法】本研究使用重叠延伸PCR技术,并通过连续传代来构建稳定遗传野生型单增李斯特菌Lm 928株的Lm 4 b_02324基因缺失株(Lm 928Δm 4 b_02324)与Lm 4 b_02324基因回补株(C Lm 928Δm 4 b_02324)。通过检测不同培养时间的D_(600)nm值并绘制生长曲线分析Lm 928、Lm 928ΔLm 4 b_02324和C Lm 928ΔLm 4 b_023243株菌的生长特性;对小鼠腹腔注射不同浓度的3株菌,观察感染后临床症状,统计死亡率,通过寇氏法计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD 50);将Lm 928、Lm 928ΔLm 4 b_02324和C Lm 928ΔLm 4 b_02324以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10分别感染HCMEC细胞,通过检测感染后不同时间细胞内的细菌数量分析各菌株的黏附与侵袭能力和胞内生存能力;提取野生株与缺失株DNA,使用prfA、mpl、hly等9对毒力相关因子的引物,利用实时荧光定量PCR技术测定其表达情况。【结果】分别成功获得了大小为1209 bp的基因缺失株Lm 928ΔLm 4 b_02324(野生株:2517 bp)和1301 bp的回补株C Lm 928ΔLm 4 b_02324(野生株:1301 bp,条带一致),且缺失株传至15代后未出现回复突变现象;生长曲线结果显示,野生株、缺失株和回补株的生长状况差异不显著(P>0.05);LD 50测定结果显示,与野生型相比缺失株LD 50显著降低(P<0.05);黏附与侵袭力试验结果显示,缺失株的胞内存活数显著或极显著高于野生株与回补株(P<0.05;P<0.01);感染HBMEC细胞12 h内,缺失株的胞内活菌数显著高于野生株(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,Lm 4 b_02324基因的缺失使得prfA、inlA、plcA基因表达显著降低(P<0.05);hly、actA、mpl、inlC基因表达极显著降低(P<0.01)。【结论】本研究结果表明,Lm 4 b_02324基因缺失会导致单增李斯特菌对小鼠的致死率升高并增强其在胞内增殖能力 展开更多
关键词 单增李斯特菌 缺失株 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 胞内生存
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热稳定6-磷酸-β-葡萄糖苷酶TteBglB异源表达、分离纯化及酶学性质分析 被引量:3
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作者 刘晴 张宇微 +4 位作者 张宇宏 徐欣欣 张伟 刘波 顾青 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期52-58,20,共7页
6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.86)催化6-磷酸-葡萄糖苷类化合物(如6-磷酸-纤维二糖、6-磷酸-纤维素寡糖)产生6-磷酸-葡萄糖而使纤维素完全分解,在微生物碳源利用过程中起重要作用。腾冲嗜热厌氧杆菌是一株嗜热厌氧微生物,提供了... 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.86)催化6-磷酸-葡萄糖苷类化合物(如6-磷酸-纤维二糖、6-磷酸-纤维素寡糖)产生6-磷酸-葡萄糖而使纤维素完全分解,在微生物碳源利用过程中起重要作用。腾冲嗜热厌氧杆菌是一株嗜热厌氧微生物,提供了丰富的热稳定性蛋白基因资源。从该菌株中克隆编码6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因Ttebgl B,并在E.coli BL21(DE3)进行了异源表达。结果表明,TteBglB催化反应的最适p H为6.0、最适温度为70℃,在pH 4-10或70℃时有着良好的稳定性;同时证实,TteBglB属于糖基水解酶家族1(GH1)成员,可不依赖Mn^2+、Ni^2+、Co^2+或Fe^2+等二价金属离子而发挥催化作用。以pNPβG6P为底物时,催化反应的Km为0.054 mmol/L,Kcat为81.47/min,Vmax为0.003992 mmol/min,酶比活为18.093 U/mg。 展开更多
关键词 TteBglB 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 糖苷水解
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植物乳杆菌WU146-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白表达及生物信息学分析
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作者 缪婷婷 沈风飞 +4 位作者 张晓晓 邱胡林 徐波 尹爱国 石鹏君 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第6期62-71,共10页
植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反... 植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反应(PCR)技术成功克隆了8个WU14的糖苷水解酶,生物信息学分析表明均为糖苷水解酶1家族(GH1)的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。鉴于植物乳杆菌中该类糖苷酶鲜有报道,采用原核异源表达展开研究。序列分析表明8个酶蛋白氨基酸序列具有GH1家族的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶典型的2个保守催化位点,序列一致性在32%~74%之间。经SDS-PAGE,8个蛋白均在大肠杆菌中表达,其中BglAW14、BglCW14、BglFW14为部分可溶性表达,其余为蛋白表达,形成包涵体。生物信息学分析显示:8个基因的编码蛋白都无信号肽和跨膜结构,疏水性较强。由亚细胞定位预测可知,除BglEW14主要存在于分泌结构内和BglHW14主要存在于细胞膜外,其余6个基因都存于细胞质内。对8个6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及生物学序列分析,为进一步探究植物乳杆菌来源的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的分子机理研究奠定了基础。 展开更多
关键词 植物乳杆菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 基因克隆 蛋白表达 生物信息学分析
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利用6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在低温条件下获得酶-底物复合物实际结构的方法
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作者 王薇 刘一苇 李宏滨 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1828-1835,共8页
利用"酶晶体低温抑活底物固定"方法,在-20℃条件下,将6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(BglA)晶体与底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸(pNPβG6P)进行浸泡试验,通过X射线进行衍射数据收集并处理,获得了完整的底物电子密度图。研究... 利用"酶晶体低温抑活底物固定"方法,在-20℃条件下,将6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(BglA)晶体与底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸(pNPβG6P)进行浸泡试验,通过X射线进行衍射数据收集并处理,获得了完整的底物电子密度图。研究结果表明,在不突变酶中关键基团使酶失活,以及不选用底物类似物替代原有底物的情况下,通过上述方法,可以获得酶与底物复合物的实际结构。该研究结果可为今后低温酶学及复合物中间态的进一步研究提供帮助。 展开更多
关键词 低温 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 晶体 衍射数据 底物电子密度图
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腾冲嗜热厌氧杆菌6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的表达与结晶及其功能鉴定 被引量:6
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作者 尹捷 刘一苇 +4 位作者 李洁 马延和 向华 严景华 高福 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期916-924,共9页
6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(PbgL,EC3.2.1.86)催化由磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PEP-PTS)转运入胞内的某些磷酸化二糖水解.一段来自腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)编码PbgL(436个氨基酸残基)的开放阅读框(ORF T... 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(PbgL,EC3.2.1.86)催化由磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PEP-PTS)转运入胞内的某些磷酸化二糖水解.一段来自腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)编码PbgL(436个氨基酸残基)的开放阅读框(ORF TTE0337)被成功克隆,并在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中有活性地表达.序列分析显示,该6-磷酸-β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶家族4(GH4),与枯草杆菌(Bacillus subtilis)的LicH,海栖热袍菌(Thermotoga Maritima)的BglT的一致性分别为62%和40%.纯化后的重组PbgL(rPbgL)经SDS-PAGE分析,为1条分子量约50kD的蛋白条带,与推测的分子量大小一致.该酶需要Mn2+、NAD+和还原剂为辅因子,能专一性地水解pNPβG6P,并在85℃达到最高酶活性.Western免疫印迹实验,利用针对rPbgL的多克隆抗体血清,能从腾冲嗜热厌氧杆菌胞内检测到PbgL的表达.此外,rPbgL的蛋白晶体已被筛选获得,并收集到2.4分辨率的衍射数据.采用分子置换法的结构解析目前仍在进行中. 展开更多
关键词 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(PbgL) 糖基水解家族4(GH4) 蛋白结晶 耐热性
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