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真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin的构建及其在293T细胞中的表达 被引量：1
1
作者 刘建巨 吴雅臻 +3 位作者 李辉南 吴荒 刘茂雄 刘殊 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2006年第2期153-154,158,共3页
目的构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin并检测其在真核细胞内的表达水平。方法将带有信号肽的Vasostatin基因片段克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染293T细胞,通过Westernb... 目的构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin并检测其在真核细胞内的表达水平。方法将带有信号肽的Vasostatin基因片段克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染293T细胞,通过Westernblot法,检测其在293T细胞内的表达水平。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Va-sostatin转染293T细胞后,在其裂解的上清液中,检测到目的基因的表达。结论已成功构建了pcDNA3.1(+)-Vasostatin表达载体,并在真核细胞中表达了目的蛋白。 展开更多
关键词 VASOSTATIN 293T细胞 基因克隆 真核表达
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蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对293T细胞凋亡的抑制作用及蛋白Caspae-8的表达
2
作者 王秀丽 王齐敏 +1 位作者 徐长庆 张力 《黑龙江医学》 2006年第12期894-895,共2页
目的研究蛋白酪氨酸磷酸酶对去血清方法诱导人胚肾293T细胞的凋亡抑制作用及相关蛋白caspase-8的表达。方法将pIRES-GFP空载体,pIRES-SHP-2通过脂质体方法转染293T细胞,去血清作用后,用噻唑蓝(MTT)法观察细胞存活率,用免疫组织化学方法... 目的研究蛋白酪氨酸磷酸酶对去血清方法诱导人胚肾293T细胞的凋亡抑制作用及相关蛋白caspase-8的表达。方法将pIRES-GFP空载体,pIRES-SHP-2通过脂质体方法转染293T细胞,去血清作用后,用噻唑蓝(MTT)法观察细胞存活率,用免疫组织化学方法检测caspase-8表达。结果去血清培养的293T细胞,随着去血清时间的延长,细胞生存率逐渐降低,而转染SHP-2组的细胞生存率明显高于对照组及空载体组;Caspase-8免疫组化检测结果显示,SHP-2组的Caspase-8阳性表达率明显低于对照组及空载体组。结论SHP-2可能通过抑制Caspase-8信号传导通路,对细胞的生存起到正向调节作用。 展开更多
关键词 SLIP-2 293T细胞 去血清 凋亡 CASPASE-8
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小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达 被引量：3
3
作者 李淼 陈伟 +5 位作者 安新江 曹军华 范从海 尹力扬 张春霞 孙浩淼 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期198-202,共5页
本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pC... 本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移载体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒;同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒;通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度可达到108TU/ml。以重组慢病毒颗粒感染293FT细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95%,FCM及Western blot结果显示感染后293FT细胞表达CXCR4蛋白。结论:成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达。 展开更多
关键词 CXC型趋化因子受体4 慢病毒载体 基因表达 293FT细胞
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携带Fluc和ZsGreen双报告基因小鼠iPS细胞系的建立 被引量：2
4
作者 樊全荣 史俊文 +5 位作者 贾俊双 高飞 张余琴 赵尊兰 姚开泰 肖东 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期10-16,共7页
背景与目的:诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)在修复受损组织器官和治疗人类疾病方面已展示了良好的应用前景,但iPS细胞具有形成畸胎瘤的作用,这是其安全应用于临床的巨大障碍之一。为此本研究拟利用慢病毒... 背景与目的:诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)在修复受损组织器官和治疗人类疾病方面已展示了良好的应用前景,但iPS细胞具有形成畸胎瘤的作用,这是其安全应用于临床的巨大障碍之一。为此本研究拟利用慢病毒体外感染的方法,建立携带萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,ZsGreen)双报告基因的小鼠iPS细胞系,为活体动态监测畸胎瘤形成、定植和形成畸胎瘤所需最小细胞剂量等提供实验基础。方法:构建含Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体。以pLH2BmRFP质粒为模板,PCR扩增获得Fluc基因片段,将其克隆至利用BamHⅠ酶切的pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen质粒中,挑选一个阳性克隆质粒进行测序,最终获得携带双报告基因的慢病毒载体pEF1a-Fluc-IRES-ZsGreen(pELZG)。采用脂质体介导的瞬时转染生产携带Fluc和ZsGreen基因的病毒,收集病毒上清,并感染iPS细胞,数天后荧光显微镜下观察是否有绿色荧光的iPS细胞克隆,不断挑取ZsGreen阳性的iPS细胞克隆以进一步纯化。将标记好的iPS细胞移植入裸鼠皮下,观察成瘤情况。结果:pELZG载体分别经XbaⅠ、PvuⅡ、SacⅠ单酶切,得到的片段大小分别为10.005、3.282和6.723 kb,2.441、3.401和6.604 kb,预示成功构建了Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体。利用其生产的病毒上清成功感染iPS细胞,经过不断的纯化,最终获得含稳定表达Fluc和ZsGreen双报告基因的小鼠iPS细胞系。将标记好的iPS细胞植入裸鼠皮下后,观察到畸胎瘤的形成。结论:成功建立了携带Fluc和ZsGreen双报告基因的小鼠iPS细胞系,为相关后续研究打下了良好的基础。标记后的iPS细胞对畸胎瘤的形成和发展具有很好的示踪作用。 展开更多
关键词 萤火虫荧光素酶 绿色荧光蛋白 慢病毒 293T细胞 诱导性多潜能干细胞 畸胎瘤
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重组腺病毒Ad5/F35-HF2S的构建及其鉴定 被引量：3
5
作者 李千音 黄峥兰 +2 位作者 高淼 钟梁 冯文莉 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第11期1434-1438,共5页
目的构建携带HA标签的重组腺病毒Ad5F35-HF2S。方法体外合成HA标签DNA双链,以K562细胞cDNA为模板,分别扩增FKBP1、FKBP2和SH2基因,依次亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV-HA中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化... 目的构建携带HA标签的重组腺病毒Ad5F35-HF2S。方法体外合成HA标签DNA双链,以K562细胞cDNA为模板,分别扩增FKBP1、FKBP2和SH2基因,依次亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV-HA中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAd5/F35在Ad5/F35-BJ5183感受态细胞中同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,经2轮扩增后,测定病毒滴度;采用PCR及Western blot法检测感染细胞中HF2S基因的转录及蛋白的表达。结果重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S及重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S经鉴定均构建正确;经包装及2轮扩增后,重组腺病毒Ad5/F35-HF2S病毒滴度可达1013IU/ml;经PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的HF2S基因能够在AD-293细胞中表达。结论已成功构建了表达HF2S基因的重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,为研究Grb2-SH2结构域在CML中的基因治疗和作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 生长因子受体结合蛋白 SH2 FKBP 重组腺病毒 AD-293细胞
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