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液质联用(LC／MS)技术在单克隆抗体(曲妥珠单抗)结构表征上的应用 被引量：13
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作者 Henry Shion Asish Chakraborty +5 位作者 YU Ying-qing 陈熙 孙庆龙 Scott Berger CHEN Wei-bin 宋兰坤 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期418-426,431,共10页
目的:应用LC/MS(液质联用)和LC/MSE方法(液相色谱/非数据依赖二级质谱数据采集方法,等频率切换高与低碰撞能量进行质谱数据扫描)对单克隆抗体(曲妥珠单抗,人源化单克隆免疫球蛋白IgG1)的结构进行深度表征。方法:先用LC/MS对曲妥珠单抗... 目的:应用LC/MS(液质联用)和LC/MSE方法(液相色谱/非数据依赖二级质谱数据采集方法,等频率切换高与低碰撞能量进行质谱数据扫描)对单克隆抗体(曲妥珠单抗,人源化单克隆免疫球蛋白IgG1)的结构进行深度表征。方法:先用LC/MS对曲妥珠单抗完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量进行测定;然后用多种酶(胰蛋白酶和AspN)酶解蛋白并用LC/MSE肽图分析法对曲妥珠单抗的氨基酸全序列进行解析和确定,同时对可能发生的翻译后修饰(PTMs)进行定性和定量分析。再通过PNGase F酶来释放抗体上的糖链并应用LC/FLR/MS(液相色谱荧光检测与质谱联用)方法对其糖基化修饰进行结构分析及确认。结果:对曲妥珠单抗的完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量测定得到良好的质量准确度,由此可判定特定蛋白修饰在轻链和重链上的分布。通过对曲妥珠单抗酶解后的氨基酸全序列确认,可对其翻译后修饰以及可能的错误氨基酸序列进行解析。该抗体肽图分析的氨基酸序列覆盖率是100%。糖基化分析是通过对游离的N-链接寡糖进行2-AB荧光标记后再用LC/FLR/MS(液相色谱荧光检测与质谱联用)方法来进行的。联合使用这些分析方法,能够有效地对不同批号和不同工艺的抗体药物进行常规质量检测和深度表征,控制药物质量,为患者提供安全可靠的生物治疗药品。结论:结合液质联用(LC/MS和LC/MSE)技术,通过完整蛋白相对分子质量的测量,肽图分析测定氨基酸序列以及翻译后修饰的定性和定量分析,结合游离N-链接寡糖的分析表征,对单克隆抗体曲妥珠单抗进行了全面的结构表征,并建立了一套单克隆抗体结构表征的平台化方案。 展开更多
关键词 曲妥珠单抗 单克隆抗体 序列变异 翻译后修饰 PTMS N-链接糖基化 寡糖 微观非均质特征 单克隆抗体表征 完整蛋白相对分子质量测量 肽图谱 肽图 序列覆盖率 糖链分析 2-ab标记 UPLC QTof MS LC MS LC MS E BiopharmaLynx 液相色谱荧光检测与质谱联用
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促红素N-糖链的超高压液相色谱分析方法验证
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作者 李响 秦玺 +3 位作者 裴德宁 于雷 史新昌 周勇 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期598-604,共7页
目的:应用超高压液相色谱方法对促红素N-糖链分析并进行方法学验证,为相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:用N-糖苷酶将促红素N-糖链酶切下后,进行2-AB衍生化标记,采用磁珠法纯化后进行液相分析,以pH 4.4的100 mmol·L^(-1)甲... 目的:应用超高压液相色谱方法对促红素N-糖链分析并进行方法学验证,为相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:用N-糖苷酶将促红素N-糖链酶切下后,进行2-AB衍生化标记,采用磁珠法纯化后进行液相分析,以pH 4.4的100 mmol·L^(-1)甲酸铵溶液为流动相A液,70%乙腈为流动相B液,梯度洗脱70.0 min,荧光检测器检测,激发光波长260 nm、发射光波长430 nm。对该方法进行了相应的方法学验证。结果:考察了方法进样和制备重复性,峰簇1~5的峰面积百分比的RSD不高于4.08%,保留时间的RSD均不高于2.89%。方法中间精密度考察结果显示,峰簇1~5的峰面积百分比的RSD不高于11.85%,保留时间的RSD均不高于8.05%。方法准确度考察中,峰簇2,3,4相对峰面积回收率分别为98.28%~113.01%,98.68%~102.96%,98.51%~100.75%。在蛋白含量为2.5~7.5 mg·mL^(-1)(即促红素蛋白量50~150μg)时,峰簇1~5峰面积线性回归的决定系数均>0.99。设定方法定量限为蛋白量50μg,所制备的样品4℃放置48 h内稳定。结论:实验结果显示该方法的专属性、精密度、准确度和线性均良好,可为促红素N-糖质控方法的建立和验证提供参考。 展开更多
关键词 N-糖链 促红素 方法学验证 2-ab标记 质量控制
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