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pCGN-HAM-N1-wcAPC质粒的构建及其功能
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作者 方喜平 冯茂辉 +6 位作者 谢伟 王国洲 陈双倩 阳芳 柳琨 杨倩 陈大平 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期2194-2197,共4页
目的 构建带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC及探讨其功能.方法 制备高效率感受态；用聚合酶链反应（PCR）扩增,将腺瘤息肉病（APC）基因截短的片段APC1克隆于T载体；同时将pCMV-neo-bam-APC酶切,得到APC基因的另一个8300... 目的 构建带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC及探讨其功能.方法 制备高效率感受态；用聚合酶链反应（PCR）扩增,将腺瘤息肉病（APC）基因截短的片段APC1克隆于T载体；同时将pCMV-neo-bam-APC酶切,得到APC基因的另一个8300 bp截短片段kAPC亚克隆于pCGN-HAM-N1真核表达载体,得重组质粒pCGN-HAM-N1-kAPC；再运用双酶Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ同时酶切TA克隆、pCGN-HAM-N1-kAPC,将APC1片段插入载体pCGN-HAM-N1-kAPC,获含野生型全长APC基因重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC.用酶切,测序鉴定.脂质体法分别将含全长,截短的重组质粒,空载体与WNT信号系统的β-连环蛋白（β-catenin）、topflash和荧光素酶共同转染293T细胞,利用双荧光报告测试系统,检测转染后荧光素酶活性.结果 重组质粒经酶切其大小与预期一致,经测序比对证实与GeneBank中给出的序列一致.转染pCGN-HAM-N1-wcAPC组的荧光素酶活性明显低于转染空载体组pCGN-HAM-N1（P＜0.05）.结论 含野生型全长9000 bp大片段APC基因分段成功插入pCGN-HAM-N1载体,带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC构建成功,pCGN-HAM-N1-wcAPC抑制T细胞因子/淋巴增强因子（Tcf/Lef）启动子的活性. 展开更多
关键词 高效感受态 腺瘤息肉病基因 克隆 重组质粒 启动子
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