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猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中非结构蛋白Nsp2表达分析 被引量：4
1
作者 温贵兰 张涵淞 +5 位作者 扈鸿霞 章先 张毅 王晓杜 李肖梁 方维焕 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1109-1116,共8页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组蛋白纯化后作为免疫抗原,制备Nsp2特异性单克隆抗体。将携带nsp2基因的真核表达载体转染至Marc-145及HEK293细胞,或将PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间点收集细胞样品。免疫荧光观察Nsp2在转染细胞中的亚细胞定位,免疫印迹分析Nsp2在真核细胞中的表达。筛选获得了1株稳定分泌特异性抗Nsp2的单克隆杂交瘤细胞株,能用于免疫荧光和印迹分析。重组真核表达质粒转染Marc-145与HEK293细胞后,Nsp2主要定位于细胞质中,免疫印迹检测到约为120与50ku的蛋白条带。PRRSV感染Marc-145细胞4h即可检测到Nsp2的表达,主要定位于细胞核周围,随着感染时间延长Nsp2分布范围逐渐扩大至整个细胞质。病毒感染8h,可检测到120ku左右的Nsp2蛋白条带,感染后12h可检测到70和50ku左右的Nsp2蛋白,且蛋白表达量随感染时间延长显著增多。PRRSV感染细胞中Nsp2的表达与剪切分析,为深入研究该蛋白在病毒复制和致病中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白nsp2 表达与剪切方式
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株致弱毒株特异性抗原表位的鉴定 被引量：1
2
作者 姜一峰 周艳君 +10 位作者 田志军 安同庆 肖燕 韦天超 王瑜 彭金美 于海 李国新 闫丽萍 张善瑞 童光志 《中国动物传染病学报》 CAS 2009年第3期1-7,共7页
通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV)HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2(Nonstndural protein2)蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2... 通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV)HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2(Nonstndural protein2)蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11(749KGEPVSDQPAK759)能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变(S754)处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸(754SDQPAK759)C端缩短到第3个氨基酸(749KGEPVSDQ757)时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为753VSDQ756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65-11变异位点C754→S754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65-11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。 展开更多
关键词 PRRSV HuN4株 非结构蛋白nsp2 抗原表位
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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白原核表达纯化及其蛋白酶活性分析 被引量：1
3
作者 瞿洪仁 李耀东 +1 位作者 侯艳红 严景华 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1502-1509,共8页
【目的】表达并纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2(Nsp2),分析Nsp2的蛋白酶活性。【方法】本研究通过PCR分别扩增nsp2基因的N端和C端,利用原核表达载体pET21a(+)表达Nsp2蛋白的N端和C端(即Nsp2-N和Nsp2-C),通过Ni-NTA琼脂糖亲和层... 【目的】表达并纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2(Nsp2),分析Nsp2的蛋白酶活性。【方法】本研究通过PCR分别扩增nsp2基因的N端和C端,利用原核表达载体pET21a(+)表达Nsp2蛋白的N端和C端(即Nsp2-N和Nsp2-C),通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析和凝胶过滤的方法纯化两个重组蛋白。预测Nsp2-N含有半胱氨酸蛋白酶结构域,本研究利用western blot检测其顺式酶切蛋白酶活性;并人工合成潜在的十肽底物,利用体外多肽酶切实验检测其反式酶切蛋白酶活性。成功获得Nsp2-N和Nsp2-C蛋白的可溶性表达,纯化后纯度高达90%,预测的Nsp2-N蛋白酶结构域在顺式切割和反式切割下均无法发挥蛋白酶活性。【结论】推测Nsp2-N中所预测的蛋白酶结构域其活性的发挥还需要其他宿主因子的辅助作用,为进一步鉴定其生物活性和筛选抗病毒药物研究提供基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白nsp2 亲和层析 凝胶过滤
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稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP_2细胞株的建立及其对p65核转位影响的研究 被引量：1
4
作者 温贵兰 张升波 +1 位作者 李昌红 徐丽 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期851-853,867,共4页
为建立一株稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP_2)的细胞株,本研究通过脂质体2000介导的方法将携带有PRRSV NSP_2基因序列的真核表达载体(pcDNA3.1-5'Flag-Nsp_2)瞬时转染于HEK293细胞,应用G418筛选、间接免疫荧... 为建立一株稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP_2)的细胞株,本研究通过脂质体2000介导的方法将携带有PRRSV NSP_2基因序列的真核表达载体(pcDNA3.1-5'Flag-Nsp_2)瞬时转染于HEK293细胞,应用G418筛选、间接免疫荧光(IFA)与western blot方法进行鉴定,获得了1株稳定表达NSP_2的阳性细胞株,命名为NSP_2-11C1-HEK293;将TNF-α作用于该细胞株,采用IFA分析稳转细胞内NSP_2对p65入核的影响。IFA结果显示NSP_2主要在细胞浆中围绕细胞核表达,在细胞中的表达率达95%以上;western blot结果显示出现120 ku的蛋白条带,与预期相符。结果表明本研究获得了一株稳定表达NSP_2的阳性细胞株,在该稳转细胞内NSP_2对p65的入核并没有影响,这为进一步研究揭示PRRSV的致病机理奠定基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白nsp2 稳定表达
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GS15株NSP2蛋白多位点缺失病毒的拯救与体外生长特性分析
5
作者 张兴民 张婧 +13 位作者 孙普 李娇阳 崔占鼎 李国秀 王健 李平花 袁红 李坤 曹轶梅 付元芳 李冬 赵志荀 曾巧英 卢曾军 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期2307-2322,共16页
【目的】本实验室前期在高致病性毒株PRRSV/GSWW/2015的感染性克隆上,拯救获得了非结构蛋白(non-structural protein 2,NSP2)第519-565位和第628-747位氨基酸双缺失的工程病毒(r GS15-?2)。本研究旨在在双缺失病毒的感染性克隆上,构建... 【目的】本实验室前期在高致病性毒株PRRSV/GSWW/2015的感染性克隆上,拯救获得了非结构蛋白(non-structural protein 2,NSP2)第519-565位和第628-747位氨基酸双缺失的工程病毒(r GS15-?2)。本研究旨在在双缺失病毒的感染性克隆上,构建拯救获得NSP2三个位点缺失的工程病毒。【方法】在前期双缺失病毒感染性克隆的基础上,利用融合PCR方法分别构建缺失NSP2第323-364位和第372-433位优势抗原表位的两个3个位点缺失的重组质粒。经脂质体介导,转染Marc-145细胞拯救病毒,通过电子显微镜观察、免疫荧光实验、测定病毒滴度、绘制生长曲线等方法对缺失病毒的生长特性进行分析。【结果】成功获得拯救病毒r GS15-?3-1和r GS15-?3-2。电子显微镜下可以观察到直径大小为50-80 nm的病毒粒子;免疫荧光实验检测表明,拯救病毒与亲本病毒GS15一致,都能检测到PRRSV N蛋白表达;缺失区域RT-PCR扩增鉴定,拯救病毒传至40代缺失标记稳定存在;r GS15-△3-1与r GS15-△3-2病毒滴度分别为2.00×10^(6.0)TCID_(50)/m L和2.25×10^(5.8)TCID50/m L,与亲本病毒相比病毒滴度差异显著(P<0.05);生长曲线分析表明拯救病毒复制水平低于亲本病毒达到最高滴度的培养时间比亲本病毒延迟24 h。【结论】本研究通过对PRRSV基因2型非结构蛋白NSP2多位点缺失病毒的体外生长特性分析,为研制新型PRRSV标记疫苗奠定了基础,也为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供新的策略。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性克隆 非结构蛋白2(nsp2) 缺失标记 生长特性
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2016—2017年广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因遗传变异分析 被引量：1
6
作者 王艳午 覃燕灵 +5 位作者 董建国 于林洋 刘燕玲 张乐宜 吴志君 宋长绪 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第23期96-101,共6页
为了深入了解2016—2017年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR法对从广东省规模化猪场采集的106份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的肺脏病料进行鉴定,并对分离的PRRSV毒株NSP2基因构建遗传进化... 为了深入了解2016—2017年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR法对从广东省规模化猪场采集的106份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的肺脏病料进行鉴定,并对分离的PRRSV毒株NSP2基因构建遗传进化树,以及进行同源性分析和氨基酸序列比对。结果表明:经RT-PCR法检测有12份病料为阳性,阳性率为11.32%;分离毒株均为美洲型毒株,有11株毒株与高致病性猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(Highly-pathogenicPRRSV,HP-PRRSV)毒株在同一分支上,1株毒株与以NADC30为代表的毒株在同一分支上;同源性分析显示,PRRSVNSP2基因序列与VR-2332的同源性为53.0%~76.7%,与CH-1a的同源性为51.9%~92.5%,与HuN4的同源性为51.3%~98.2%,与JXA1的同源性为51.6%~98.3%,与NADC30的同源性为51.5%~92.2%,与JXA1-P80的同源性为50.9%~98.3%;氨基酸序列比对结果显示,与美洲型代表株VR-2332和低致病性毒株CH-1a相比,除GDth毒株外其余11株PRRSV毒株在高变区均有多处氨基酸位点发生突变。说明2016—2017年广东地区PRRSV流行株以高致病性毒株为主,并且出现NADC30样毒株。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 肺脏 高致病性 病毒分离 非结构蛋白2(nsp2) 流行病学分析
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