【目的】对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白7(nonstructural protein 7,NSP7)进行真核表达及生物信息学分析,从而推测其在PRRSV复制过程中的功能。【方法】按照GenBank...【目的】对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白7(nonstructural protein 7,NSP7)进行真核表达及生物信息学分析,从而推测其在PRRSV复制过程中的功能。【方法】按照GenBank数据库中NSP 7基因序列合成目的基因并构建真核表达载体P3×FLAG-CMV-NSP7,瞬时转染Marc-145细胞后通过Western blotting验证蛋白表达,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)对NSP7蛋白进行亚细胞定位,利用生物信息学分析软件预测NSP7蛋白的理化性质、结构及功能。【结果】成功构建P3×FLAG-CMV-NSP7真核表达载体;Western blotting结果显示,获得大小约为2.7 ku的目的条带,证实重组载体在Marc-145细胞中高效表达。IFA结果证实在PRRSV感染初期NSP7蛋白大部分分布于细胞质中,随着感染时间延长NSP7蛋白由细胞质进入细胞核。生物信息学分析结果显示,NSP7蛋白由259个氨基酸编码,分子式为C _(1284) H _(2020) N _(348) O _(379) S_( 8),分子质量为28652.75 u,理论等电点为5.88,为不稳定、亲水蛋白。结构预测发现,NSP7蛋白二级结构包括α-螺旋和β-转角,占比分别为35.91%和5.41%。核定位序列分析发现,NSP7蛋白具有一段跨膜序列RLNKKKRRRMEAVGIF。【结论】本研究成功构建高效表达的PRRSV NSP7真核表达载体,在PRRSV感染初期NSP7蛋白分布于细胞质,感染后期分布于细胞核,NSP7蛋白存在核定位序列。展开更多
目的：表达纯化人星状体病毒（ human astrovirus， HAstV）非结构蛋白nsP1a／1，免疫动物制备多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增nsP1a／1基因序列，构建到大肠埃希菌原核表达系统中表达重组nsP1a／1蛋白，使用镍柱亲和层析法对重组蛋白...目的：表达纯化人星状体病毒（ human astrovirus， HAstV）非结构蛋白nsP1a／1，免疫动物制备多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增nsP1a／1基因序列，构建到大肠埃希菌原核表达系统中表达重组nsP1a／1蛋白，使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）和二噻啉甲酸（BCA）实验对重组蛋白的纯度与浓度进行分析，以重组的nsP1a／1蛋白为抗原，免疫雄性SPF级SD 大鼠获得多抗血清，用 ELISA 测定抗体效价、 Western 印迹检测抗体特异性。结果nsP1a／1-pET28a原核表达载体构建成功，将其转化至大肠埃希菌BL21（DE3）细菌中诱导表达了重组蛋白，免疫大鼠获得的多抗血清几何平均效价达到1∶406374。结论本实验成功地运用原核表达系统表达并鉴定了人星状体病毒非结构蛋白nsP1a／1，为进一步研究人星状病毒的复制及病毒感染的临床诊断奠定基础。展开更多
文摘【目的】对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白7(nonstructural protein 7,NSP7)进行真核表达及生物信息学分析,从而推测其在PRRSV复制过程中的功能。【方法】按照GenBank数据库中NSP 7基因序列合成目的基因并构建真核表达载体P3×FLAG-CMV-NSP7,瞬时转染Marc-145细胞后通过Western blotting验证蛋白表达,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)对NSP7蛋白进行亚细胞定位,利用生物信息学分析软件预测NSP7蛋白的理化性质、结构及功能。【结果】成功构建P3×FLAG-CMV-NSP7真核表达载体;Western blotting结果显示,获得大小约为2.7 ku的目的条带,证实重组载体在Marc-145细胞中高效表达。IFA结果证实在PRRSV感染初期NSP7蛋白大部分分布于细胞质中,随着感染时间延长NSP7蛋白由细胞质进入细胞核。生物信息学分析结果显示,NSP7蛋白由259个氨基酸编码,分子式为C _(1284) H _(2020) N _(348) O _(379) S_( 8),分子质量为28652.75 u,理论等电点为5.88,为不稳定、亲水蛋白。结构预测发现,NSP7蛋白二级结构包括α-螺旋和β-转角,占比分别为35.91%和5.41%。核定位序列分析发现,NSP7蛋白具有一段跨膜序列RLNKKKRRRMEAVGIF。【结论】本研究成功构建高效表达的PRRSV NSP7真核表达载体,在PRRSV感染初期NSP7蛋白分布于细胞质,感染后期分布于细胞核,NSP7蛋白存在核定位序列。
文摘目的：表达纯化人星状体病毒（ human astrovirus， HAstV）非结构蛋白nsP1a／1，免疫动物制备多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增nsP1a／1基因序列，构建到大肠埃希菌原核表达系统中表达重组nsP1a／1蛋白，使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）和二噻啉甲酸（BCA）实验对重组蛋白的纯度与浓度进行分析，以重组的nsP1a／1蛋白为抗原，免疫雄性SPF级SD 大鼠获得多抗血清，用 ELISA 测定抗体效价、 Western 印迹检测抗体特异性。结果nsP1a／1-pET28a原核表达载体构建成功，将其转化至大肠埃希菌BL21（DE3）细菌中诱导表达了重组蛋白，免疫大鼠获得的多抗血清几何平均效价达到1∶406374。结论本实验成功地运用原核表达系统表达并鉴定了人星状体病毒非结构蛋白nsP1a／1，为进一步研究人星状病毒的复制及病毒感染的临床诊断奠定基础。
