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新型核素报告基因系统hERL／核素标记雌二醇的实验研究 被引量：5
1
作者 兰晓莉 覃春霞 +4 位作者 田月丽 夏晓天 何勇 袁辉 张永学 《中华核医学与分子影像杂志》 CSCD 北大核心 2012年第1期10-15,共6页
目的在体外细胞摄取实验及在体显像基础上，评价新型核素报告基因系统人ER配体结合域（hERL）／核素标记雌二醇（E2）应用的可行性，为其用于基因治疗的监测提供依据。方法以内部核糖体进入位点序列（IRES）方式构建携带hERL和治疗VEGF... 目的在体外细胞摄取实验及在体显像基础上，评价新型核素报告基因系统人ER配体结合域（hERL）／核素标记雌二醇（E2）应用的可行性，为其用于基因治疗的监测提供依据。方法以内部核糖体进入位点序列（IRES）方式构建携带hERL和治疗VEGF165的重组质粒pDC316-hERL-IRES．VEGF165（简写为EIV），将其用腺病毒包装构建重组腺病毒复合体（Ad-EIV）。采用悬浮贴壁法从sD大鼠股骨和胫骨原代提取骨髓MSCs并培养。将Ad-EIV和脂质体2000包裹重组质粒（Lipo-EIV）分别转染MSCs，利用RT-PCR和Westernblot，对hERL和VEGF165mRNA和蛋白质水平的表达分别进行检测。测定Ad．EIV组、Lipo．EIV组和未转染组MSCs对125I-E在不同时间（1、3,6、9、12和24h）的摄取率。将转染Ad-EIV的MSCs注射至大鼠左前肢、未转染MSCs注射至右前肢后1d，注射16a-^18TMF-17a-E2（^18F-FES）进行micro PET／CT活体显像。2组间均数比较采用t检验，相关性研究采用Pearson相关分析。结果Ad—EIV转染MSCs后RT—PCR检测示hERL和VEGFl65mRNA的表达随着感染滴度的增加而增加，且呈正相关（r2分别为0．953和0．966，P均〈0．05）；感染复数（MOI）=25、50、75和100时，其mRNA表达高于Lipo-EIV组。Westernblot检测蛋白质水平的表达也得到同样的结果。Ad-EIV组和Lipo-EIV组MSCs对^125I-E2的摄取率均随时间延长逐渐增高，24h最高，分别达到（10．94±0．30）％和（8．934-0．18）％；各个时间点2种载体转染组均明显高于未转染对照组（3．54％-5．52％；t值分别为15．489-26．560、10．523-24．204，P均〈0．05），而Ad-EIV组摄取率高于Lipo-EIV组（t=g．132—16．168，P均〈0．05）。MicroPET／CT大鼠活体显像显示注射Ad-EIV转染的MSCs之左前肢放射性浓聚明显高于对侧。结论报告基因hERL可以通过腺病毒转染、脂质体包裹等多种形式转染细胞并成功表达，应用核素标记E2可以对其� 展开更多
关键词 基因 报告 雌激素受体配体结合域 放射性核素显像 雌二醇 同位素标记 大鼠
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MCF10A-Er-Src诱导转化模型的构建
2
作者 任雪 程谟斌 +1 位作者 张业 沈珝琲 《医学研究杂志》 2014年第10期29-32,共4页
目的构建能够被他莫西芬(tamoxifen,TAM)激活的MCF10A-Er-Src诱导转化模型。方法利用PCR扩增法分别获得雌激素受体配体结合结构域序列(hbER)和Src序列,并将其分别插入到改造后的反转录病毒表达载体pMSCV-FLAG-HA中,构建ER-Src融合蛋白... 目的构建能够被他莫西芬(tamoxifen,TAM)激活的MCF10A-Er-Src诱导转化模型。方法利用PCR扩增法分别获得雌激素受体配体结合结构域序列(hbER)和Src序列,并将其分别插入到改造后的反转录病毒表达载体pMSCV-FLAG-HA中,构建ER-Src融合蛋白表达质粒。包装pMSCV-ER-Src-FLAG-HA重组反转录病毒,感染MCF10A,利用基因组PCR和Western blot法筛选能够稳定表达外源融合蛋白ER-Src的细胞系。利用免疫沉淀(IP)和Western blot法验证TAM对稳转细胞系的激活,并观察细胞形态变化。结果构建的MCF10A-Er-Src细胞系能够稳定表达ER-Src融合蛋白。TAM能诱使Src第416位酪氨酸发生磷酸化,从而激活Src,使MCF10A-Er-Src发生转化。结论成功获得能够被TAM诱导激活的MCF10A-Er-Src转化模型。 展开更多
关键词 人乳腺表皮细胞 雌激素受体配体结合结构域-Src融合蛋白 他莫西芬 细胞转化
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优化雌激素受体α蛋白的可溶性表达条件
3
作者 路晓庆 白文启 +5 位作者 刘向荣 杨芮 张继萍 郭晋锋 陈晓霞 张桓虎 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1223-1225,共3页
目的构建雌激素受体α配体结合域(ERα-LBD)表达载体,优化表达条件得到可溶性ERα-LBD蛋白。方法在Addgene网站检索关键词ESR(雌激素受体,estrogen receptor),选择符合条件的质粒载体pcDNA-HA-ER WT(Addgene plasmid # 49498;http://n2t... 目的构建雌激素受体α配体结合域(ERα-LBD)表达载体,优化表达条件得到可溶性ERα-LBD蛋白。方法在Addgene网站检索关键词ESR(雌激素受体,estrogen receptor),选择符合条件的质粒载体pcDNA-HA-ER WT(Addgene plasmid # 49498;http://n2t.net/addgene:49498;RRID:Addgene49498),设计引物并扩增得到目的片段ERα-LBD,分别构建蛋白表达载体pET-28a-LBD和pGEX-4T1-LBD,改变诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度以及诱导时间对表达条件优化。待细菌裂解并提取蛋白后进行凝胶电泳,可在细菌上清的泳道中观察到明显的紫色蛋白表达条带,即为可溶性ERα-LBD蛋白。结果 pET-28a-LBD重组质粒未能表达重组蛋白ERα-LBD,重组质粒pGEX-4T1-LBD在Rosetta和BL21(DE3)感受态中以1 mmol/L IPTG诱导仅能得到包涵体;以0.2 mmol/L IPTG 16 ℃过夜诱导培养,则可得到可溶性ERα-LBD蛋白。结论成功构建ERα-LBD表达载体并优化诱导表达条件,获得可溶性ERα-LBD蛋白。 展开更多
关键词 雌激素受体α配体结合域 重组表达载体 条件优化 可溶性表达
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hERα-LBD原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定
4
作者 王艳芳 赵继军 +1 位作者 田再民 郭彦峰 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期61-65,共5页
目的构建人雌激素受体α亚型配体结合区(hERα-LBD)的原核表达载体,并进行表达蛋白的活性鉴定。方法以hERα-LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα-LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体(pGEM-T-easy)连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性... 目的构建人雌激素受体α亚型配体结合区(hERα-LBD)的原核表达载体,并进行表达蛋白的活性鉴定。方法以hERα-LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα-LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体(pGEM-T-easy)连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性菌落经酶切和测序鉴定,和pET-28a(+)质粒分别进行双酶切,T4DNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD,转化到大肠杆菌JM109和BL21感受态细胞中。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白;将雌二醇-牛血清白蛋白(BSA)偶联抗原(E2-BSA)与融合蛋白混合,通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性。结果 PCR扩增的hERα-LBD基因片段约为1.9kb,与预期目的片段大小一致。与T载体连接,形成pGM-T-hERα-LBD重组质粒,转化到感受态细胞,阳性菌落酶切和测序鉴定正确,与pET-28a(+)质粒酶切后连接,成功构建原核重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD;在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERα-LBD蛋白。经亲和色谱法纯化后,hERα-LBD蛋白的表达量可达250mg/L。电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性。结论成功构建原核重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD,hERα-LBD具有雌激素结合活性。 展开更多
关键词 雌激素受体α亚型配体结合区 表达载体活性
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