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太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光定位 被引量：1
1
作者 董复成 崔岩 +1 位作者 任有蛇 张春香 《中国草食动物科学》 CAS 2020年第6期1-5,共5页
试验旨在研究太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光定位,采用细胞免疫荧光技术通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光情况。结果表明:①不同一抗浓度对Lcn5呈现荧光图像影响较大,浓度稀释比例越大,浓度越小,... 试验旨在研究太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光定位,采用细胞免疫荧光技术通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光情况。结果表明:①不同一抗浓度对Lcn5呈现荧光图像影响较大,浓度稀释比例越大,浓度越小,荧光阳性信号越弱,适宜的一抗浓度稀释比为1∶50;不同二抗浓度对Lcn5阳性信号无显著影响,荧光二抗稀释比例为1∶100时荧光更清晰。②激光共聚焦显微镜扫描结果显示,Lcn5在细胞核和细胞质中均有表达;细胞培养到4 h时Lcn5在细胞核中大量表达,出现较强的阳性信号,并且在视野下发现培养液中有颗粒状的阳性信号。综上所述,推测Lcn5可能在附睾头细胞培养的过程中在细胞内合成并分泌到细胞外,对附睾微环境的构建起到了作用,同时可能参与精子的成熟过程。 展开更多
关键词 太行山羊 附睾头细胞 Lcn5 定位
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β防御素124沉默通过p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达 被引量：1
2
作者 孟繁荣 邰苗苗 +4 位作者 董复成 任有蛇 刘文忠 乔利英 张春香 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1248-1259,共12页
旨在研究山羊β防御素124(goat beta-defensin 124,gBD124)沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀... 旨在研究山羊β防御素124(goat beta-defensin 124,gBD124)沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2μg·mL^-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达(P<0.05),显著增加了RASA1基因表达(P<0.05);gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达(P<0.05);gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达(P<0.05),下调了CCL5和IL-1α基因表达(P<0.05);gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度(P<0.05)。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度(P<0.05)。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。 展开更多
关键词 附睾头细胞 β防御素124 shRNA慢病毒载体 p38MAPK/AP1通路 山羊
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山羊附睾头细胞转染中新霉素和嘌呤霉素的浓度筛选 被引量：2
3
作者 邰苗苗 吴小叶 +3 位作者 杜海燕 孟繁荣 张春香 任有蛇 《山西农业科学》 2017年第10期1691-1694,共4页
通过对9月龄黑山羊附睾头细胞进行不同浓度、不同时间新霉素和嘌呤霉素的处理,收集各个时间的细胞并进行计数,旨在研究山羊附睾头细胞对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度。结果显示,山羊附睾头细胞在转染时对新霉素和嘌呤霉素适宜的质量浓度... 通过对9月龄黑山羊附睾头细胞进行不同浓度、不同时间新霉素和嘌呤霉素的处理,收集各个时间的细胞并进行计数,旨在研究山羊附睾头细胞对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度。结果显示,山羊附睾头细胞在转染时对新霉素和嘌呤霉素适宜的质量浓度分别为400,2μg/m L;试验细胞计数结果与细胞生长状态相一致,山羊附睾细胞与其他哺乳动物不同组织器官对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度基本一致。研究结果可为后期基因敲除和过表达载体转染进山羊附睾头细胞时抗性基因浓度的确定提供了参考,也为后期基因功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 山羊附睾头细胞 新霉素 嘌呤霉素
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山羊β防御素124定位及过表达附睾头上皮细胞系的建立 被引量：2
4
作者 黄鑫芸 张俊梅 +3 位作者 邰苗苗 孟繁荣 任有蛇 张春香 《山西农业科学》 2022年第10期1476-1481,共6页
为研究山羊β防御素124(BD124)的生物学功能,进行附睾头上皮细胞BD124的定位研究,并建立BD124过表达附睾头上皮细胞系,应用细胞免疫荧光法对山羊附睾头上皮细胞BD124进行定位;将山羊BD124基因编码区序列连接到LV5穿梭质粒后,测序验证LV5... 为研究山羊β防御素124(BD124)的生物学功能,进行附睾头上皮细胞BD124的定位研究,并建立BD124过表达附睾头上皮细胞系,应用细胞免疫荧光法对山羊附睾头上皮细胞BD124进行定位;将山羊BD124基因编码区序列连接到LV5穿梭质粒后,测序验证LV5-BD124质粒构建情况,然后将其与包装质粒共转染293T细胞进行包装生产并重组LV5-BD124慢病毒,并采用有限稀释法测定病毒滴度;之后采用实时荧光定量PCR和Western blot检测确认LV5-BD124慢病毒侵染96、120 h后山羊附睾头上皮细胞中BD124 mRNA和蛋白的过表达情况;最后用嘌呤霉素进行2次筛选后获得BD124过表达稳转附睾头上皮细胞系。定位结果显示,BD124阳性绿色荧光信号在细胞核周围高度聚集,且在细胞质和细胞核内也有分布。测序结果显示,BD124序列插入LV5慢病毒载体后,表达的LV5-BD124慢病毒载体滴度为3.0×108 TU/mL。荧光定量PCR和Western blot结果显示,LV5-BD124附睾头上皮BD124 mRNA和蛋白表达量显著高于对照组;LV5-BD124侵染后的附睾头上皮细胞经2次嘌呤霉素筛选后,阳性细胞比例增加,传2代后细胞内荧光信号保持稳定。 展开更多
关键词 山羊 附睾头上皮细胞 β防御素124 稳转系
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雄激素和氢化可的松对山羊附睾头上皮细胞增殖的影响 被引量：1
5
作者 栾兆进 范晓梅 +3 位作者 宋慧子 栗瑞兰 张通 张家新 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期91-98,共8页
为研究雄激素和氢化可的松对山羊附睾上皮细胞生长的作用模式,本研究利用酶标仪检测附睾头部上皮细胞增殖情况,实时荧光定量PCR及ELISA检测雄激素受体(AR)的表达,检测睾酮与氢化可的松对山羊附睾上皮细胞体外增殖的作用以及对AR表达的... 为研究雄激素和氢化可的松对山羊附睾上皮细胞生长的作用模式,本研究利用酶标仪检测附睾头部上皮细胞增殖情况,实时荧光定量PCR及ELISA检测雄激素受体(AR)的表达,检测睾酮与氢化可的松对山羊附睾上皮细胞体外增殖的作用以及对AR表达的影响。结果表明:100nmol/L睾酮对附睾头上皮细胞增殖的促进效应最高且与对照组差异极显著(P<0.01),200nmol/L氢化可的松促进附睾头上皮细胞增殖效应最佳并与对照组差异显著(P<0.05),前者的效应明显且可以被AR阻断剂阻断;睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞增殖表现为协同作用;100nmol/L睾酮与200nmol/L氢化可的松均使附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量上调,与对照组差异显著(P<0.05),且二者共存时附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量极显著高于对照组(P<0.01)。本研究表明睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞体外增殖均有促进作用,呈明显的浓度依赖性,且二者之间存在协同作用,这为进一步研究附睾上皮细胞增殖及功能的调节机理提供了基础。 展开更多
关键词 睾酮 氢化可的松 附睾头上皮细胞 细胞增殖 雄激素受体
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1,25(OH)_(2)D_(3)及VDR敲除对山羊附睾头上皮细胞β防御素家族表达的影响
6
作者 王丽 郭雅茹 +4 位作者 张俊梅 雷铭凯 王振国 张春香 任有蛇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1990-2000,共11页
旨在研究1,25(OH)_(2)D_(3)是否通过VDR途径调节山羊附睾头上皮细胞β防御素基因表达。本试验选取3只6月龄太行黑山羊,分别采集附睾头组织。采用差速贴壁法分离山羊附睾头上皮细胞,用细胞免疫荧光鉴定上皮细胞纯度。添加100 nmol·L... 旨在研究1,25(OH)_(2)D_(3)是否通过VDR途径调节山羊附睾头上皮细胞β防御素基因表达。本试验选取3只6月龄太行黑山羊,分别采集附睾头组织。采用差速贴壁法分离山羊附睾头上皮细胞,用细胞免疫荧光鉴定上皮细胞纯度。添加100 nmol·L^(-1)1,25(OH)_(2)D_(3)处理附睾头上皮细胞以及筛选出敲除效率最高的pCas9/gRNA1质粒载体进行细胞转染,同时设置阴性对照组和空白对照组,每组3个重复孔。附睾头上皮细胞经1,25(OH)_(2)D_(3)处理以及VDR基因敲除后,分别用qRT-PCR检测VDR和17种β防御素基因的表达,用Western blot检测VDR蛋白和3种β防御素蛋白的表达。结果表明,1,25(OH)_(2)D_(3)能极显著提高VDR、gBD124、gBD126和gBD104a的mRNA和蛋白表达(P<0.01),同时极显著提高gBD104、gBD 109tr1、gBD 109tr2、gBD113、gBD116、gBD120、gBD 121以及gBD 123基因的表达(P<0.01),显著提高gBD106、gBD127、gBD 129以及gBD 134基因的表达(P<0.05),而对gBD 110like和gBD 128基因没有显著影响(P>0.05);3个基因敲除载体进行细胞转染后,pCas9-VDR-V1组VDR蛋白表达极显著降低(P<0.01)。VDR基因敲除极显著降低gBD124的mRNA和蛋白表达(P<0.01),显著降低gBD126和gBD104a的mRNA和蛋白表达(P<0.05),同时VDR基因敲除组gBD 109tr1、gBD 109tr2、gBD116、gBD123、gBD127、gBD 128以及gBD 134基因的表达极显著低于其他组(P<0.01),VDR基因敲除组gBD104、gBD106、gBD 120以及gBD 129基因的表达显著低于其他组(P<0.05),而对gBD121、gBD 110like以及gBD 113的相对表达则无显著影响(P>0.05)。综上所述,1,25(OH)_(2)D_(3)可以上调VDR和部分β防御素表达;VDR基因敲除后降低部分β防御素表达,结果表明1,25(OH)_(2)D_(3)通过上调VD/VDR信号通路关键基因VDR的表达调控山羊附睾头上皮细胞部分β防御素表达。 展开更多
关键词 Β防御素 1 25(OH)_(2)D_(3) 维生素D受体 基因敲除 附睾头上皮细胞
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