目的研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、...目的研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、感染滴度等检定,根据结果稀释、分装,制备成候选标准品;采用热加速试验对候选标准品进行稳定性考察;组织3家实验室,采用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法对候选标准品进行协作标定。结果候选标准品原液及候选标准品的各项检测指标均符合相关要求;在25、4、-20、-40、-80℃条件下,1、3、4、6个月基因组滴度均无明显下降;经3家实验室协作标定,候选标准品赋值为2.56×10^(12)copies/mL,95%置信区间为2.48×1012~2.64×10^(12)copies/mL。结论研制的rAAV5基因组滴度测定用国家标准品具有良好的稳定性,可用于rAAV5相关产品的质量评价。展开更多
目的探讨以重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus of the serotypes2,rAAV2)为载体对体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞(Marginal cells,MCs)转染锰超氧化物歧化酶(Manganese SuperoxideDismutase,MnSOD),获得高表达MnSOD...目的探讨以重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus of the serotypes2,rAAV2)为载体对体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞(Marginal cells,MCs)转染锰超氧化物歧化酶(Manganese SuperoxideDismutase,MnSOD),获得高表达MnSOD转基因缘细胞的可行性。方法实验组按感染复数(MOI)为104v.g./cell对体外培养的血管纹缘细胞转染rAAV2-MnSOD-EGFP,同时设转染rAAV2-EGFP缘细胞作为空载对照组,未转染细胞为空白对照组。荧光显微镜下每2d观察1次MCs的绿色荧光蛋白(Enhenced green fluorescentprotein,EGFP)表达情况。比色法测定各组MCs的MnSOD活性。激光共聚焦显微镜下观察转染rAAV2-MnSOD-EGFP后MnSOD的表达,免疫印迹法(Western blot)定量分析MnSOD的表达。结果(1)各组MCs转染后,生长正常,空载对照组MCs转染rAAV2-EGFP后2天开始出现微弱EGFP的表达,1周后至高峰;实验组转染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出现EGFP的表达,10d至高峰,且持续表达于细胞培养的整个期间。EGFP的表达在荧光显微镜490nm波长激发光下呈黄绿色,弥漫于整个胞质。(2)对激光共聚焦显微镜及Westernblot的检测结果进行分析,实验组较空载对照组和空白对照组的MCs中MnSOD的表达明显升高,差异有统计学意义。结论rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地转染体外培养的MCs并持续高表达MnSOD。展开更多
文摘目的研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、感染滴度等检定,根据结果稀释、分装,制备成候选标准品;采用热加速试验对候选标准品进行稳定性考察;组织3家实验室,采用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法对候选标准品进行协作标定。结果候选标准品原液及候选标准品的各项检测指标均符合相关要求;在25、4、-20、-40、-80℃条件下,1、3、4、6个月基因组滴度均无明显下降;经3家实验室协作标定,候选标准品赋值为2.56×10^(12)copies/mL,95%置信区间为2.48×1012~2.64×10^(12)copies/mL。结论研制的rAAV5基因组滴度测定用国家标准品具有良好的稳定性,可用于rAAV5相关产品的质量评价。
文摘目的探讨以重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus of the serotypes2,rAAV2)为载体对体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞(Marginal cells,MCs)转染锰超氧化物歧化酶(Manganese SuperoxideDismutase,MnSOD),获得高表达MnSOD转基因缘细胞的可行性。方法实验组按感染复数(MOI)为104v.g./cell对体外培养的血管纹缘细胞转染rAAV2-MnSOD-EGFP,同时设转染rAAV2-EGFP缘细胞作为空载对照组,未转染细胞为空白对照组。荧光显微镜下每2d观察1次MCs的绿色荧光蛋白(Enhenced green fluorescentprotein,EGFP)表达情况。比色法测定各组MCs的MnSOD活性。激光共聚焦显微镜下观察转染rAAV2-MnSOD-EGFP后MnSOD的表达,免疫印迹法(Western blot)定量分析MnSOD的表达。结果(1)各组MCs转染后,生长正常,空载对照组MCs转染rAAV2-EGFP后2天开始出现微弱EGFP的表达,1周后至高峰;实验组转染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出现EGFP的表达,10d至高峰,且持续表达于细胞培养的整个期间。EGFP的表达在荧光显微镜490nm波长激发光下呈黄绿色,弥漫于整个胞质。(2)对激光共聚焦显微镜及Westernblot的检测结果进行分析,实验组较空载对照组和空白对照组的MCs中MnSOD的表达明显升高,差异有统计学意义。结论rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地转染体外培养的MCs并持续高表达MnSOD。
