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重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展 被引量：17
1
作者 王帅 杨艳歌 +4 位作者 吴占文 李红娜 李涛 孙冬梅 袁飞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第9期297-305,共9页
随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物(微生物)因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物(微生物)因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行... 随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物(微生物)因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物(微生物)因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行生物成分检测而被广泛应用,尤其是新发展起来的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)、重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术。这3种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和、引物设计更简单等优点,且检测原理相似,本文对这3种技术进行对比研究,从原理、概念以及近年来在食源性致病菌快速检测方面的研究应用情况进行综述,概括其在食品检测中的优势和面临的实际问题,并对未来的发展前景进行展望。 展开更多
关键词 重组酶聚合酶扩增 重组酶介导等温扩增 酶促重组等温扩增 食源性致病菌 快速检测
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肉制品中鸡源性成分重组酶介导等温扩增检测方法的建立及应用 被引量：13
2
作者 苗丽 张秀平 +4 位作者 王建昌 王永亮 程奇 徐超 张璐 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期954-959,共6页
为了快速准确检测出肉制品中的鸡源性成分,本研究基于鸡线粒体细胞色素B基因(CytB),设计特异性引物和exo探针,建立了实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)方法,进行特异性、灵敏性和稳定性分析,并通过检测市售肉制品对所建立RAA方法的准确... 为了快速准确检测出肉制品中的鸡源性成分,本研究基于鸡线粒体细胞色素B基因(CytB),设计特异性引物和exo探针,建立了实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)方法,进行特异性、灵敏性和稳定性分析,并通过检测市售肉制品对所建立RAA方法的准确性和适用性进行分析。结果表明,该方法可以快速实现对高山鸡肉、乌鸡肉、芦花鸡肉、白羽鸡肉和野鸡肉基因组DNA的特异性扩增,而对猪肉、牛肉、羊肉等的DNA均没有扩增,可稳定检出的鸡源性成分最低质量分数为0.1%。在9份标识有鸡肉成分的市售样品中,7份检出鸡源性成分,有2份样品的鸡源性成分检测结果为阴性。本研究建立的实时荧光RAA方法操作简单,反应迅速,特异性强,灵敏度高,为肉制品中鸡源性成分的检测提供了技术保障。 展开更多
关键词 重组酶介导等温扩增 细胞色素B基因 鸡源性成分
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多杀性巴氏杆菌荧光RAA快速检测方法的建立 被引量：5
3
作者 杜秋明 郑秀红 +5 位作者 樊晓旭 赵永刚 乔启波 南文龙 许龙春 吴晓东 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第2期120-125,共6页
为建立一种敏感特异、简便快速的多杀性巴氏杆菌检测方法,根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因保守区序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件优化筛选,建立了重组酶介导的等温扩增(RAA)荧光检测方法。结果显示,建立的多杀性巴氏杆菌RAA荧光检... 为建立一种敏感特异、简便快速的多杀性巴氏杆菌检测方法,根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因保守区序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件优化筛选,建立了重组酶介导的等温扩增(RAA)荧光检测方法。结果显示,建立的多杀性巴氏杆菌RAA荧光检测方法在39℃恒温条件下20 min内即可特异性的检出多杀性巴氏杆菌,与鸭疫里默氏杆菌、副猪嗜血杆菌、支原体、链球菌、大肠杆菌、附红细胞体、新孢子虫无交叉反应,方法的最低检出限为10 copies/μL,组内和组间重复性试验的变异系数均小于10%,用该方法对45份临床样本进行检测,结果阳性率为33.33%,与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的多杀性巴氏杆菌荧光RAA检测方法操作简单、反应时间短、具有较高的特异性和敏感性,不依赖于复杂的仪器,适合临床上对多杀性巴氏杆菌的快速检测。 展开更多
关键词 多杀性巴氏杆菌 重组酶介导等温扩增 快速检测
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基于重组酶介导等温扩增技术的鸡滑液囊支原体检测方法建立和初步应用 被引量：7
4
作者 卞红春 余树培 +5 位作者 杨凌 陈静华 陈丽珠 程珂 尹彦 夏文龙 《中国家禽》 北大核心 2022年第7期37-42,共6页
为建立一种鸡滑液囊支原体(MS)快速简便的检测方法,研究根据MS vlhA基因保守序列设计3对引物,通过引物筛选和条件优化,建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的MS检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评估。应用该方法对68份鸡咽喉拭子... 为建立一种鸡滑液囊支原体(MS)快速简便的检测方法,研究根据MS vlhA基因保守序列设计3对引物,通过引物筛选和条件优化,建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的MS检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评估。应用该方法对68份鸡咽喉拭子临床样品进行检测,并和农业行业标准中的PCR方法进行对比。结果显示:该方法最佳引物为vlhA F3/vlhA R3,在38℃孵育25 min即可完成靶基因扩增,并且特异性强,与鸡毒支原体(MG)、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门菌、鸡大肠杆菌、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒(AIBV)、鸡传染性法氏囊病病毒等其他鸡病病原体无交叉反应;灵敏度高,对MS基因组DNA的最低检出限度为15.5 pg;应用该方法从68份临床样品中检出阳性样品29份,与PCR方法检测结果一致。研究表明,建立的RAA方法快速简便,不依赖昂贵的仪器设备,有望用于基层实验室或MS的临床快速诊断。 展开更多
关键词 鸡滑液囊支原体 重组酶介导等温扩增 检测
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重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌 被引量：7
5
作者 姚丽锋 冯家望 +7 位作者 张娟 黎财慧 丁琦 张晴阳 严家俊 游淑珠 符家忍 王小玉 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2022年第17期5695-5701,共7页
目的建立重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)法快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基... 目的建立重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)法快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基因组DNA进行检测,确定方法的特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,比对不同检测方法对食品样品的检出限。结果建立的铜绿假单胞菌lasB基因RAA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有扩增曲线,对其他致病菌无交叉反应;方法对纯菌液的灵敏度为1.7 pg/μL。人工污染实验表明,方法对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限与传统方法一致,达1.0×103CFU/mL;RAA方法检测时间仅需20min。结论本研究建立的铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短,可用于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 lasB基因 重组酶介导等温扩增
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猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法的建立与应用 被引量：3
6
作者 王颖 戚睿斌 +7 位作者 崔赛赛 杨育鹏 冯可昕 刘家森 姜骞 杨鸣发 康洪涛 曲连东 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期29-33,共5页
为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1... 为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1。灵敏性试验结果显示,RAA最低检测限为7.60×101copies/μL,比普通PCR最低检测限高100倍。特异性试验结果显示,该RAA方法与猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒无交叉反应。对34份临床样本进行检测,其中13份为阳性,阳性检出率为38.23%。综上所述,本研究成功建立了猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒 重组酶介导等温扩增 快速检测方法
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基于重组酶介导等温扩增-CRISPR/Cas12a的青鱼物种快速鉴定研究 被引量：1
7
作者 于耀鲜 邢冉冉 +5 位作者 邓婷婷 王琳 卢思远 王宏勋 王丽梅 陈颖 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第4期40-48,共9页
目的 建立一种快速、特异、灵敏地鉴定青鱼物种的方法。方法 以青鱼线粒体16SrRNA基因的保守序列设计特异性crRNA,并根据crRNA设计重组酶介导等温扩增(recombinase-mediatedisothermal amplification,RAA)引物;建立青鱼的RAA-CRISPR/Cas... 目的 建立一种快速、特异、灵敏地鉴定青鱼物种的方法。方法 以青鱼线粒体16SrRNA基因的保守序列设计特异性crRNA,并根据crRNA设计重组酶介导等温扩增(recombinase-mediatedisothermal amplification,RAA)引物;建立青鱼的RAA-CRISPR/Cas12a快速鉴定方法,并对该方法的检测时间进行优化;同时,评估该方法的特异性和灵敏度,并对青鱼及其近缘物种的市售样品进行检测。结果 该方法仅需25 min完成检测;对青鱼物种的鉴定表现出显著的特异性,并对其近缘物种如草鱼、赤眼鳟、鳡鱼、倒刺鲃的检测结果均呈阴性;方法灵敏度为1.0×10-3ng/μL(以基因组DNA计);与DNA条形码技术相比,该方法在市售样品的检测结果上表现一致。结论 建立了青鱼物种的RAA-CRISPR/Cas12a现场快速检测方法,该方法具备快速、特异、灵敏的特点,为水产市场或野外环境中快速检测青鱼物种提供了技术手段。 展开更多
关键词 青鱼 重组酶介导等温扩增 簇状规则间隔短链重复序列 物种鉴定
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阿卡斑病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用 被引量：2
8
作者 宋瑞鹏 刘金凤 +12 位作者 钟华 孙倩 陈赫威 陈凤莲 覃绍敏 林俊 陆晨阳 秦树英 许力士 韦珊珊 马玲 韦珏 吴健敏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期552-558,共7页
为建立一种快速检测阿卡斑病毒(AKAV)的分子生物学检测方法,本研究通过比较分析AKAV基因组序列,在S基因保守序列区域设计重组酶介导等温扩增(RAA)引物及探针,筛选最佳引物对,然后对RAA反应温度、引物浓度以及探针浓度进行优化,建立了AKA... 为建立一种快速检测阿卡斑病毒(AKAV)的分子生物学检测方法,本研究通过比较分析AKAV基因组序列,在S基因保守序列区域设计重组酶介导等温扩增(RAA)引物及探针,筛选最佳引物对,然后对RAA反应温度、引物浓度以及探针浓度进行优化,建立了AKAV的荧光逆转录重组酶介导的核酸等温扩增(RT-RAA)快速检测方法。结果显示,所建立的荧光RT-RAA方法在42℃反应20 min即可快速检测出AKAV,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL,与牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等无交叉反应,并具有良好的重复性。对37份临床样品进行检测,阳性检出率为43.24%,与RT-qPCR检测结果符合率为94.59%。结果表明,建立的AKAV荧光RT-RAA快速检测方法具有快速、特异、灵敏、稳定等特点,可为AKAV的现场快速检测提供可靠方法。 展开更多
关键词 阿卡斑病毒 重组酶介导等温扩增 快速检测
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沙门菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的应用研究 被引量：6
9
作者 周冬根 罗洁 《中国热带医学》 CAS 2019年第2期107-110,119,共5页
目的建立基于重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification, RAA)快速、灵敏、特异检测沙门菌的方法。方法针对沙门菌invA基因保守区段设计特异性引物、探针,通过引物、探针筛选以及反应条件优化,建立检测沙门菌的荧光RAA方法,... 目的建立基于重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification, RAA)快速、灵敏、特异检测沙门菌的方法。方法针对沙门菌invA基因保守区段设计特异性引物、探针,通过引物、探针筛选以及反应条件优化,建立检测沙门菌的荧光RAA方法,通过优化引物浓度、探针浓度、醋酸镁浓度、上样量来确定最佳反应体系组成。采用细菌纯培养物评估该方法的最低检测限、特异性等性能,通过模拟样品以及19份真实样品检测,同时采用国标法GB 4789.4-2016同步验证复核,评估该检测方法的可靠性。结果该方法在39℃条件下20 min内可完成检测反应。利用该方法能够特异检测沙门菌,不能检出其他肠道致病菌。该方法检测细菌纯培养物的灵敏度为19 cfu/mL,检测模拟样品的灵敏度为190 cfu/mL。采用建立的沙门菌荧光RAA方法对采集的环境样品、食品污染及人体肛拭子样品共计19份进行检测,按照GB 4789.4-2016方法同步检测,4份阳性,其中3份样本荧光RAA检测呈现沙门菌阳性,1份肛拭子样本该方法未能检出。结论荧光重组酶介导等温扩增法检测沙门菌快速、特异、简便、灵敏,能够在食源性疫情现场调查以及食源性疾病监测中发挥一定的作用。 展开更多
关键词 重组酶介导等温扩增 沙门菌 监测
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RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价
10
作者 章太婵 车玉传 +5 位作者 梁雪雁 韦华贵 范向平 黄承仕 林敏 陈江涛 《临床检验杂志》 CAS 2024年第4期246-251,共6页
目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计R... 目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA引物和CRISPR来源RNA(crRNA),优化检测体系中乙酸镁(MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以100~106 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37℃条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1×102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2,与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 重组酶介导等温扩增 CRISPR/Cas12a 侧流层析 快速检测
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重组酶介导等温扩增技术检测疟原虫方法的建立和评价 被引量：3
11
作者 邵雷 赵松 +3 位作者 刘燕红 应清界 杨坤 林红 《中国热带医学》 CAS 2022年第7期617-622,共6页
目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术(RAA)检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA(18S rRNA)基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准... 目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术(RAA)检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA(18S rRNA)基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准质粒、4种疟原虫[恶性疟原虫(Plasmodium falciparum, P.f)、间日疟原虫(P. vivax,P.v)、三日疟原虫(P. malaria, P.m)、卵形疟原虫(P. ovale, Po)]病原体以及其他6种输血传播寄生虫(婴儿利士曼原虫、杜氏利士曼原虫、刚地弓形虫、溶组织阿米巴虫、犬吉氏巴贝西虫、田鼠巴贝虫),以评估该体系的灵敏度和特异度。结果 筛选出一组扩增效果较好的引物对,整个RAA体系使用最佳引物对在37℃,20 min即可完成扩增,对标准质粒的检测下限为10-2copies/μL,恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫为102copies/μL,三日疟原虫为10 copies/μL。RAA检测体系未与其他输血传播寄生虫产生交叉反应,特异性良好。应用RAA方法检测外籍学生献血者标本,结果与荧光定量PCR结果一致。结论 成功建立了一种快速、简便和特异的疟原虫RAA检测方法,将会给血液筛查和一些基层偏远医院的临床检测提供很大帮助。 展开更多
关键词 疟原虫 重组酶介导等温扩增 18S核糖体RNA 分子诊断
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猪附红细胞体重组酶介导等温扩增技术(RAA)荧光检测方法的建立 被引量：3
12
作者 杜秋明 郑秀红 +5 位作者 樊晓旭 赵永刚 乔启波 南文龙 许龙春 吴晓东 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2181-2185,共5页
为建立一种准确、快速的猪附红细胞体检测方法,根据猪附红细胞体α-烯醇化酶基因保守序列设计特异性引物和探针,经过筛选优化反应条件,建立了重组酶介导的等温扩增(RAA)荧光检测方法。结果显示,建立的方法在39℃恒温条件下20 min内即可... 为建立一种准确、快速的猪附红细胞体检测方法,根据猪附红细胞体α-烯醇化酶基因保守序列设计特异性引物和探针,经过筛选优化反应条件,建立了重组酶介导的等温扩增(RAA)荧光检测方法。结果显示,建立的方法在39℃恒温条件下20 min内即可特异性地检出猪附红细胞体,与猪肺炎支原体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、非洲猪瘟病毒、健康猪血液无交叉反应,方法的最低检出限为1 copy/μL。用该方法对15份临床样本进行检测,结果阳性率为60%,与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的猪附红细胞体荧光RAA检测方法具有较好的敏感性和特异性,操作简便可应用于猪附红细胞体病的临床快速检测。 展开更多
关键词 猪附红细胞体 重组酶介导等温扩增 α-烯醇化酶基因
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玉米细菌性枯萎病菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立与应用 被引量：3
13
作者 单长林 周圆 李孝军 《广东农业科学》 CAS 2021年第1期111-118,共8页
【目的】建立一种快速、灵敏、特异的玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewarii)重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法。【方法】以玉米细菌性枯萎病菌pstS-glmS基因序列作为靶标序列,设计、... 【目的】建立一种快速、灵敏、特异的玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewarii)重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法。【方法】以玉米细菌性枯萎病菌pstS-glmS基因序列作为靶标序列,设计、合成荧光RAA检测引物和探针,并进行灵敏性测定、特异性验证;使用建立的荧光RAA检测方法检测玉米模拟样本和玉米真实样本,参照标准SN/T 1375-2004方法同步复核,评估荧光RAA检测方法的可靠性。【结果】成功建立了玉米细菌性枯萎病菌荧光RAA检测方法。该方法反应快速,在39℃条件下20 min内即可完成检测反应,特异性好,且灵敏度为280 fg/μL;利用该方法检测6份模拟样本结果阳性,24份真实样本结果呈阴性,与参照标准SN/T 1375-2004检测结果一致。【结论】成功建立了玉米细菌性枯萎病菌快速、灵敏和特异的荧光RAA检测方法,可用于玉米细菌性枯萎病菌的现场检测。 展开更多
关键词 玉米细菌性枯萎病菌 pstS-glmS序列 重组酶介导等温扩增 荧光探针 快速检测
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双重荧光RT-RAA检测引起肾综合征出血热汉坦病毒方法的建立 被引量：1
14
作者 周冬根 罗洁 +2 位作者 许恒毅 童淑梅 胡群 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2022年第4期253-256,263,共5页
目的 建立汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)、汉城病毒(Seoul virus,SEOV)、普马拉病毒(Puumala virus,PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus,DOBV)4种引起肾综合征出血热病毒的快速筛查、诊断方法。方法 分析确定上述4种病毒的保守基因作为... 目的 建立汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)、汉城病毒(Seoul virus,SEOV)、普马拉病毒(Puumala virus,PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus,DOBV)4种引起肾综合征出血热病毒的快速筛查、诊断方法。方法 分析确定上述4种病毒的保守基因作为靶标区域,设计4组特异性引物和探针,组合成两组双重荧光重组酶介导等温扩增(RTRAA)反应体系。分别用4种病毒的体外转录RNA验证方法的灵敏度,采用登革病毒I-Ⅳ型、基孔肯雅病毒、黄热病毒疫苗株、乙型脑炎病毒、甲型流感病毒3型、甲型H1N1流感病毒以及乙型流感病毒核酸及4种病毒体外转录RNA进行特异性验证,分别采用中浓度(10^(4)拷贝/μl)、低浓度(10^(2)拷贝/μl)的体外转录RNA验证双检测体系的重复性。结果 通过生物信息学分析,将4种病毒组合成HTNV+SEOV组合以及PUUV+DOBV双重荧光RT-RAA检测体系,均在39℃检测15 min,检测灵敏度为1-10^(2)拷贝/μl,均与其他病毒无交叉反应。4种病毒对10^(4)拷贝/μl体外转录RNA检出率均达到100.0%,10^(2)拷贝/μl体外转录RNA检出率也能达到66.7%。结论 本研究建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于人体及鼠类样本的诊断与筛查. 展开更多
关键词 重组酶介导等温扩增 汉滩病毒 汉城病毒 普马拉病毒 多不拉伐病毒
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重组酶等温扩增技术快速检测对虾中的白斑综合征病毒
15
作者 马超 杨莉莉 +4 位作者 高子惠 张璜 贾赟 郑秋月 曹际娟 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2022年第21期6964-6971,共8页
目的针对对虾中白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV),分别建立基于国外专利技术的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)方法,基于国内专利技术的重组酶介导等温扩增(Recombinase-aided amplificatio... 目的针对对虾中白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV),分别建立基于国外专利技术的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)方法,基于国内专利技术的重组酶介导等温扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)方法,并对两种检测方法进行比较。方法应用重组酶等温扩增技术在恒温(39℃)条件下完成扩增反应,调整反应体系中模板DNA和探针浓度,优化WSSV病毒RPA和RAA两种方法的反应体系,建立了可靠稳定的等温扩增RPA和RAA快速检测方法,比较了两种方法的特异性、灵敏度、扩增效率和稳定性。结果所建立的荧光RPA和RAA方法在恒温39℃的条件下特异性检测WSSV,检测构建质粒DNA的灵敏度可达到1.0×10~6 copies/μL,检测实际感染阳性样品的灵敏度可达到1.31×101 pg/μL;RPA方法的扩增线性曲线拟合度r~2=0.9970,扩增效率为98.50%;RAA方法的扩增线性曲线拟合度r~2=0.9910,扩增效率为98.50%。结论所建立的基于重组酶等温扩增技术的RPA和RAA方法,特异性好,对于质粒和阳性样品检测灵敏度一致,扩增效率一致,具有很好稳定性,适用于水产品养殖及生产加工和通关口岸进口虾类产品中WSSV病毒的现场快速筛查防控。 展开更多
关键词 白斑综合征病毒 重组酶聚合酶扩增 重组酶介导等温扩增 现场快速检测
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双重荧光RT-RAA检测5种蚊媒病毒方法的建立
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作者 周冬根 许恒毅 +1 位作者 罗洁 胡群 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2022年第5期337-341,共5页
目的建立快速筛查登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV)、寨卡病毒(ZIKV)、黄热病毒(YFV)以及基孔肯雅病毒(CHIKV)5种蚊媒病毒的重组酶介导等温扩增(RAA)方法。方法分析上述5种病毒的保守基因作为靶标区域并引入人核糖核酸酶P(RNaseP)基... 目的建立快速筛查登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV)、寨卡病毒(ZIKV)、黄热病毒(YFV)以及基孔肯雅病毒(CHIKV)5种蚊媒病毒的重组酶介导等温扩增(RAA)方法。方法分析上述5种病毒的保守基因作为靶标区域并引入人核糖核酸酶P(RNaseP)基因作为内对照,设计6组特异性引物和探针,并根据引物二聚体和错配等生物信息学分析将6组引物和探针组合成3组双重荧光RT-RAA检测体系,在相同反应条件下进行检测。用5种病毒的体外转录RNA验证3组荧光RT-RAA检测体系的灵敏度,用疟原虫、汉坦病毒、汉城病毒以及流感病毒核酸验证方法的特异性;分别用中浓度(10^(4)拷贝/μl)、低浓度(10^(2)拷贝/μl)5种病毒的体外转录RNA验证3组双重荧光RT-RAA检测体系的重复性。结果通过生物信息学分析,将5种病毒和RNaseP组合为3组双重荧光RT-RAA检测体系,分别为DENV与ZIKV、JEV与YFV以及CHIKV与RNaseP,均在39℃反应15 min。3组双重荧光RT-RAA检测体系检测5种病毒体外转录RNA的灵敏度介于1~10^(2)拷贝/μl,其中检测DENV、ZIKV和YFV的灵敏度均为1拷贝/μl,JEV灵敏度为10拷贝/μl,CHIKV灵敏度为10^(2)拷贝/μl;3组荧光RT-RAA检测体系均与其他病毒无交叉反应。5种病毒的中浓度体外转录RNA的检出率均达到100.0%,低浓度体外转录RNA也能达到83.3%。结论本研究建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于人体及蚊类样本中5种蚊媒病毒的筛查。 展开更多
关键词 重组酶介导等温扩增 蚊媒病毒 双重检测 登革病毒 乙型脑炎病毒 寨卡病毒 黄热病毒 基孔肯雅病毒
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快速检测田鼠巴贝西虫重组酶介导核酸等温扩增方法的建立
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作者 邵雷 赵松 +4 位作者 刘燕红 叶钰滢 应清界 林红 杨坤 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第4期420-424,共5页
目的 建立快速检测田鼠巴贝西虫的重组酶介导核酸等温扩增方法(RAA)。方法 选取田鼠巴贝西虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cox I)序列,设计检测田鼠巴贝西虫的通用引物,并对引物进行筛选和特异性检测,建立并优化田鼠巴贝西虫的重组酶介... 目的 建立快速检测田鼠巴贝西虫的重组酶介导核酸等温扩增方法(RAA)。方法 选取田鼠巴贝西虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cox I)序列,设计检测田鼠巴贝西虫的通用引物,并对引物进行筛选和特异性检测,建立并优化田鼠巴贝西虫的重组酶介导核酸等温扩增体系。分别采用重组质粒和田鼠巴贝西虫成虫DNA为模板测试方法的灵敏度;利用其他种类寄生虫DNA,包括输血传播寄生虫评估该方法的特异性并对42例外籍献血者进行田鼠巴贝西虫筛查。结果 筛选出1组扩增效果良好的引物。RAA反应过程在37℃20 min完成,最低可扩增浓度为10^(-1)copies/μL的重组质粒和浓度为10^(-3)ng/μL的田鼠巴贝西虫基因组。RAA方法具有良好的特异性,与其他寄生虫无交叉阳性反应。应用RAA方法检测42例外籍献血者标本均为阴性。结论 成功建立了一种敏感、特异的检测田鼠巴贝西虫的RAA法,该方法可用于献血者血液筛查时的快速检测以及田野调查时大规模样品检测。 展开更多
关键词 田鼠巴贝西虫 重组酶介导等温扩增 核酸检测
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非洲猪瘟病毒RAA-CRISPR/LbCas12a检测方法的建立与初步应用
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作者 李朝阳 胡文阳 +3 位作者 党梦 魏战勇 朱河水 陈宇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1475-1481,共7页
本研究基于重组酶介导的扩增技术(recombinase-aid amplification,RAA),联合CRISPR/LbCas12a检测方法,筛选crRNA引物,对不同浓度阳性质粒、其他猪病病毒核酸样品、病料样品进行RAA扩增,随后进行荧光检测,探索检测ASFV的新方法。结果显示... 本研究基于重组酶介导的扩增技术(recombinase-aid amplification,RAA),联合CRISPR/LbCas12a检测方法,筛选crRNA引物,对不同浓度阳性质粒、其他猪病病毒核酸样品、病料样品进行RAA扩增,随后进行荧光检测,探索检测ASFV的新方法。结果显示,RAA-CRISPR/LbCas12a检测方法的灵敏度达1×103copies/μL,不与其他病毒核酸样品产生交叉反应。利用RAA-CRISPR/LbCas12a方法对22份灭活的猪组织病料进行临床ASFV检测,同时进行qPCR平行检测。结果显示,两种方法的检测结果相同,同时检出18份阳性。综上所述,本研究建立的ASFV RAA-CRISPR/LbCas12a检测方法具有较好的敏感性和特异性,能够在1 h内对ASFV核酸进行判定,且较为方便,在临床ASFV检测中有着一定的应用前景,对于预防非洲猪瘟有一定的推动作用。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 CRISPR/LbCas12a 重组酶介导等温扩增
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玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立
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作者 单长林 周圆 +2 位作者 任琰 季文彬 李孝军 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2021年第9期1676-1685,共10页
玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis)是进境玉米重要检疫性病原物之一。通过分析比较玉米内州萎蔫病菌的纤维素酶基因cel B,筛选出独特和保守的基因序列用于设计引物和探针,利用重组酶介导等温扩增技术(rec... 玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis)是进境玉米重要检疫性病原物之一。通过分析比较玉米内州萎蔫病菌的纤维素酶基因cel B,筛选出独特和保守的基因序列用于设计引物和探针,利用重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)建立玉米内州萎蔫病菌的荧光RAA检测方法。以cel B基因序列作为靶标序列设计出引物2F、6R和探针P,建立了玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法,该方法在39℃恒温条件下,20 min内可完成检测反应,特异性好,且灵敏度高达130 fg·μL^(-1),利用该方法检测4份玉米模拟样本阳性,8份玉米真实样品阴性,检测结果与参照国家标准GB/T 36840—2018一致。结果表明,建立的荧光RAA检测方法快速、特异、灵敏,能够满足现场检测要求。 展开更多
关键词 玉米内州萎蔫病菌 cel B序列 重组酶介导等温扩增 荧光探针 快速检测
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非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测方法的建立 被引量：13
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作者 赵凯颖 曾德新 +5 位作者 胡永新 钱炳旭 薛峰 钱莺娟 吴晓东 戴建君 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期1-8,共8页
为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L(P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量... 为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L(P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies,μL,检测时长仅需10 min,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应。对100份临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR结果一致,但相较于荧光定量PCR检测时间的2h,检测时间大大缩短。结果表明,本研究建立的方法灵敏度较高、特异性较好,为ASFV早期临床诊断提供了技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 重组酶介导等温扩增方法 检测
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