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重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建表达
1
作者 徐华 董耘 +3 位作者 杨进 刘少帮 刘少华 陈武 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2015年第20期3221-3225,共5页
背景:重组融合蛋白是根据凝血酶识别顺序将葡激酶与水蛭素串联而成的蛋白,具有双重功能,分子质量为23 ku,可在工程菌高密度发酵状态下获得高效表达。目的:通过对工程菌进行高密度发酵,构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并探讨其... 背景:重组融合蛋白是根据凝血酶识别顺序将葡激酶与水蛭素串联而成的蛋白,具有双重功能,分子质量为23 ku,可在工程菌高密度发酵状态下获得高效表达。目的:通过对工程菌进行高密度发酵,构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并探讨其构建可行性及表达价值。方法:对工程菌进行高密度培养,并诱导表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白,对菌体进行离心收取,多次冻融后通过超滤、两部阴离子交换层析方法收集上清液,对重组葡激酶-水蛭素融合蛋白进行分离纯化,观察其纤溶比活性及在菌体中的高效表达价值。结果与结论:发酵培养工程菌,并在第17小时时予以诱导。结果发现,诱导0.5 h时,便能观察到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,且发酵时间越长重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达量相应越大;至发酵20 h时,表达达到顶峰。菌体干质量为32.20 g/L,目的蛋白表达量约为1.48 g/L。经过纯化处理后,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯度高达98%,纤溶比活性约为2.6×104 IU/mg,回收活性的概率为56%。实验通过构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并分析其表达价值,提示该纯化工艺较为便捷,耗时较短,且能重复使用,可用于大规模生产。 展开更多
关键词 组织构建 组织工程 重组葡激酶-水蛭素 融合蛋白 表达
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重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质控方法和质量标准的建立 被引量：3
2
作者 丁有学 韩春梅 +3 位作者 李响 毕华 史新昌 饶春明 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第8期1024-1028,1034,共6页
目的建立注射用重组葡激酶(staphylokinase,SAK)-水蛭素(hirudin,HV)融合蛋白(SFH)的质控方法和质量标准。方法采用纤维蛋白平板溶圈(fibrin agarose plate assay,FAPA)法测定SFH的溶栓比活性,纤维蛋白凝块溶解法测定SFH的抗凝比活性;... 目的建立注射用重组葡激酶(staphylokinase,SAK)-水蛭素(hirudin,HV)融合蛋白(SFH)的质控方法和质量标准。方法采用纤维蛋白平板溶圈(fibrin agarose plate assay,FAPA)法测定SFH的溶栓比活性,纤维蛋白凝块溶解法测定SFH的抗凝比活性;还原型SDS-PAGE测定SFH的相对分子质量;非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定SFH的纯度;胰酶裂解后采用RP-HPLC法分析SFH的肽图;其他各项指标的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果用建立的方法对SFH原液和成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准能够保证产品安全、有效、质量可控,可用于注射用SFH产品的常规检定。 展开更多
关键词 重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(SFH) 质量控制
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抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建与表达 被引量：1
3
作者 徐华 徐昕 +5 位作者 杨进国 杨剑 曾文强 刘少帮 刘少华 陈武 《内科急危重症杂志》 2015年第2期138-140,共3页
目的:探讨抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建效果与抗凝溶栓活性表达情况。方法:在间接实验中,选择p BV-重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质质粒进行酵母大量表达,再进行两级纯化分析;去纯化的单位进行抗凝溶栓的检测。结果:工程菌酵... 目的:探讨抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建效果与抗凝溶栓活性表达情况。方法:在间接实验中,选择p BV-重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质质粒进行酵母大量表达,再进行两级纯化分析;去纯化的单位进行抗凝溶栓的检测。结果:工程菌酵母发酵培养诱导1 h后就可以检测到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,表达量随发酵时间的增加而递增。两级纯化的重复性非常好,纯度经RP-HPLC测定在98%以上。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的溶栓活性明显高于水蛭素与葡激酶的单纯溶栓活性(P<0.05)。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白具有更强的纤溶酶原激活活性,明显高于水蛭素与葡激酶的单纯纤溶酶原激活活性(P<0.05)。结论:重组葡激酶-水蛭素融合蛋白生产工艺具有很好的诱导与纯化效果,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白能发挥较好的抗凝与溶栓作用。 展开更多
关键词 抗凝 溶栓 重组葡激酶-水蛭素融合蛋白 酵母表达体系
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重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环抗凝溶栓中的应用比较
4
作者 李春华 赵年 陈武 《现代检验医学杂志》 CAS 2015年第2期19-22,26,共5页
目的：探讨与比较抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环中的应用优势。方法2013年2月～2014年7月，选择镍钛合金片分成未包被组（A 组）、基础包被组（壳聚糖，B 组）、壳聚糖／葡激酶（C 组），壳聚糖／水蛭素（D 组）、壳聚... 目的：探讨与比较抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环中的应用优势。方法2013年2月～2014年7月，选择镍钛合金片分成未包被组（A 组）、基础包被组（壳聚糖，B 组）、壳聚糖／葡激酶（C 组），壳聚糖／水蛭素（D 组）、壳聚糖／重组葡激酶-水蛭素融合蛋白（E 组），纳入新鲜全人血中进行溶血实验，计算溶血率与血细胞状况。同时健康新生儿脐静脉内皮细胞植入各组别的镍钛合金片，进行细胞相容性实验。结果5组样品溶血率在1.5％左右，5组的红细胞、白细胞和血小板数量均在正常范围内，各组比较差异均无统计学意义（P ＜0.05）。E 组的增殖程度与黏附程度都明显低于其他4组，对比差异明显（P ＜0.05）；A 组与 B 组的相关比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。随机双盲法细胞计数结果示 C，D 与 E 组与 A，B 组比较差异有统计学显著性意义（P ＜0.05），同时 E 组与 C，D 组对比差异也有统计学意义（P ＜0.05）。结论相对于葡激酶与水蛭素的单独应用，重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环中的应用能发挥更强的抗凝、抗血栓作用，安全性好，从而确保心血管疾病介入治疗的有效性。 展开更多
关键词 重组葡激酶-水蛭素融合蛋白 体外循环 细胞相容性 溶血
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