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重组细胞色素酶P450 3A4表达和鉴定
被引量:
1
1
作者
柳艾姣
石磊
+1 位作者
方方
赵树进
《药物生物技术》
CAS
CSCD
2012年第5期381-385,共5页
细胞色素酶P450是代谢内源性物质和外源性物质的重要的酶,在药物治疗和药物开发领域以及了解潜在的毒性物质和致癌性物质的代谢机制起决定性作用。旨在构建细胞色素酶P450 3A4的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化得到CYP3A4蛋白。用逆转...
细胞色素酶P450是代谢内源性物质和外源性物质的重要的酶,在药物治疗和药物开发领域以及了解潜在的毒性物质和致癌性物质的代谢机制起决定性作用。旨在构建细胞色素酶P450 3A4的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化得到CYP3A4蛋白。用逆转录-聚合酶链反应方法从人肝脏总RNA中得到CYP3A4的cDNA,然后直接插入pMD20-T Vector中,将测序正确的N-末端和C-末端进行修饰。然后利用双酶切插入到表达载体pET-28a-c(+)Vectors,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。并通过定点突变的方法获得CYP3A4亚型P467S(CYP3A4*19)。采用SPSS13.0设计4因素2水平正交实验,对α-ALA(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、IPTG(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、卡那霉素(50μg/mL和100μg/mL)添加浓度及菌的接种密度(接种1%和接种2%)进行优化。并用SPSS13.0对结果进行分析,选择出比较好的组合进行下一步的大规模的诱导表达。经定点突变的方法成功获得了CYP3A4*19亚型。经IPTG诱导获得CYP3A4蛋白,并通过Western blot验证。用BCA蛋白浓度定量分析试剂盒测定的膜蛋白浓度在65μg/mL左右,α-ALA、抗生素(卡那霉素)、T7启动子诱导剂IPTG及接种密度高低两水平中对膜蛋白的表达水平的影响没有统计学意义。
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关键词
重组
细胞
色素
酶
细胞
色素
酶
P450
3A4
表达
纯化
N-末端修饰
C-末端修饰
原文传递
3-氨基苯二酰肼发光法在微粒体和重组细胞色素P450酶系中的毒理学应用(英文)
2
作者
杨明学
刘毓谷
《中国药理学与毒理学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
1991年第4期312-320,共9页
本文分别从微粒体和重组细胞色素P450酶系水平,研究了3-氨基苯二酰肼(luminol)化学发光在毒理学中的应用。研究结果表明luminol化学发光法不仅可用于P450酶系活力的测定,也可用来检测反应体系中由外来化合物代谢转化而产生的自由基。自...
本文分别从微粒体和重组细胞色素P450酶系水平,研究了3-氨基苯二酰肼(luminol)化学发光在毒理学中的应用。研究结果表明luminol化学发光法不仅可用于P450酶系活力的测定,也可用来检测反应体系中由外来化合物代谢转化而产生的自由基。自由基清除剂SOD、过氧化氢酶和二甲亚砜对多种重组酶系的化学发光均有不同程度的淬灭作用,其中以SOD作用最强,其抑制率为93~100%。44种外来化合物的重组酶系化学发光的测定结果表明,已知在代谢转化过程中形成自由基的化合物,其化学发光强度明显增强,如四氯化碳、三氯甲烷、四氯乙烯等;经代谢转化后毒作用增强的化合物,其发光强度有的增强,如二硫化碳、苯、甲苯、甲基对硫磷等,有的不变或减弱,如对硫磷、苯胺、马拉硫磷等;毒作用与代谢转化关系不很密切的化合物,其发光强度与对照比较无变化或减弱,如氨基比林等,多环芳烃类和亚硝胺类致癌物的发光强度,除3-甲基胆蒽、二甲基亚硝胺外,均无明显变化。
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关键词
3-氨基苯二酰肼化学发光
微粒体
重组
细胞
色素
P450
酶
系
外来化合物
自由基
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职称材料
题名
重组细胞色素酶P450 3A4表达和鉴定
被引量:
1
1
作者
柳艾姣
石磊
方方
赵树进
机构
南方医科大学
广州军区广州总医院
出处
《药物生物技术》
CAS
CSCD
2012年第5期381-385,共5页
基金
广东省科技计划基金资助项目(No.2011B031800187)
中医药管理局(No.201200097)
文摘
细胞色素酶P450是代谢内源性物质和外源性物质的重要的酶,在药物治疗和药物开发领域以及了解潜在的毒性物质和致癌性物质的代谢机制起决定性作用。旨在构建细胞色素酶P450 3A4的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化得到CYP3A4蛋白。用逆转录-聚合酶链反应方法从人肝脏总RNA中得到CYP3A4的cDNA,然后直接插入pMD20-T Vector中,将测序正确的N-末端和C-末端进行修饰。然后利用双酶切插入到表达载体pET-28a-c(+)Vectors,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。并通过定点突变的方法获得CYP3A4亚型P467S(CYP3A4*19)。采用SPSS13.0设计4因素2水平正交实验,对α-ALA(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、IPTG(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、卡那霉素(50μg/mL和100μg/mL)添加浓度及菌的接种密度(接种1%和接种2%)进行优化。并用SPSS13.0对结果进行分析,选择出比较好的组合进行下一步的大规模的诱导表达。经定点突变的方法成功获得了CYP3A4*19亚型。经IPTG诱导获得CYP3A4蛋白,并通过Western blot验证。用BCA蛋白浓度定量分析试剂盒测定的膜蛋白浓度在65μg/mL左右,α-ALA、抗生素(卡那霉素)、T7启动子诱导剂IPTG及接种密度高低两水平中对膜蛋白的表达水平的影响没有统计学意义。
关键词
重组
细胞
色素
酶
细胞
色素
酶
P450
3A4
表达
纯化
N-末端修饰
C-末端修饰
Keywords
Recombinant cytochrome, CYP3A4, Expression, Purification, N-terminal, C-terminal
分类号
Q814 [生物学—生物工程]
原文传递
题名
3-氨基苯二酰肼发光法在微粒体和重组细胞色素P450酶系中的毒理学应用(英文)
2
作者
杨明学
刘毓谷
机构
同济医科大学环境毒理研究室
出处
《中国药理学与毒理学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
1991年第4期312-320,共9页
文摘
本文分别从微粒体和重组细胞色素P450酶系水平,研究了3-氨基苯二酰肼(luminol)化学发光在毒理学中的应用。研究结果表明luminol化学发光法不仅可用于P450酶系活力的测定,也可用来检测反应体系中由外来化合物代谢转化而产生的自由基。自由基清除剂SOD、过氧化氢酶和二甲亚砜对多种重组酶系的化学发光均有不同程度的淬灭作用,其中以SOD作用最强,其抑制率为93~100%。44种外来化合物的重组酶系化学发光的测定结果表明,已知在代谢转化过程中形成自由基的化合物,其化学发光强度明显增强,如四氯化碳、三氯甲烷、四氯乙烯等;经代谢转化后毒作用增强的化合物,其发光强度有的增强,如二硫化碳、苯、甲苯、甲基对硫磷等,有的不变或减弱,如对硫磷、苯胺、马拉硫磷等;毒作用与代谢转化关系不很密切的化合物,其发光强度与对照比较无变化或减弱,如氨基比林等,多环芳烃类和亚硝胺类致癌物的发光强度,除3-甲基胆蒽、二甲基亚硝胺外,均无明显变化。
关键词
3-氨基苯二酰肼化学发光
微粒体
重组
细胞
色素
P450
酶
系
外来化合物
自由基
Keywords
luminol-dependent chemilumine scence
microsomes
reconstituted cytochrome P450 enzyme system
xenobiotics
free radicals
分类号
R992 [医药卫生—毒理学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
重组细胞色素酶P450 3A4表达和鉴定
柳艾姣
石磊
方方
赵树进
《药物生物技术》
CAS
CSCD
2012
1
原文传递
2
3-氨基苯二酰肼发光法在微粒体和重组细胞色素P450酶系中的毒理学应用(英文)
杨明学
刘毓谷
《中国药理学与毒理学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
1991
0
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职称材料
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