OX40L通过激活树突状细胞促进重组狂犬病病毒免疫早期抗体的产生

1

作者 王玉芳 高婷 +6 位作者 邢潇 王勇 字绍美 刘亚萍 胡杨 李康 李莹莹 《免疫学杂志》 CAS CSCD 2024年第5期425-432,共8页

目的明确重组狂犬病病毒(LBNSE-OX40L)过表达的OX40L能否通过激活树突状细胞增强先天性免疫反应进而激活早期抗体的产生。方法体外研究:从Balb/c小鼠股骨提取骨髓源树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)培养6 d,用感染复数(MO... 目的明确重组狂犬病病毒(LBNSE-OX40L)过表达的OX40L能否通过激活树突状细胞增强先天性免疫反应进而激活早期抗体的产生。方法体外研究:从Balb/c小鼠股骨提取骨髓源树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)培养6 d,用感染复数(MOI)=1的亲本病毒LBNSE和重组病毒LBNSE-OX40L感染培养好的BMDCs,通过流式细胞术分析各病毒对BMDCs成熟情况的影响和ELISA方法检测感染BMDCs上清中与先天性免疫相关细胞因子α干扰素(interferon-α,IFN-α)和白细胞介素12p40(interleukin-12p40,IL-12p40)的表达情况。体内研究:Balb/c雌鼠双后肢肌肉注射106 FFU的亲本病毒LBNSE和重组病毒LBNSE-OX40L,免疫后第6天收集小鼠腹股沟淋巴结,经流式细胞术检测成熟DCs比例,在免疫后第6天收集小鼠血清,通过抗病毒中和抗体滴定法检测病毒中和抗体(virus neutralizing antibody,VNA)含量,通过ELISA检测小鼠血清中IgG抗体;在免疫后第2、4、6天通过ELISA检测IgM抗体亚类含量。结果与亲本病毒LBNSE相比,重组病毒LBNSE-OX40L能够在体外激活显著多的BMDCs,并产生显著高水平的IFN-α和IL-12p40,且重组病毒LBNSE-OX40L能刺激体内DCs成熟分化,迅速产生高水平的VNA和RABV特异性IgG和IgM抗体亚类。结论LBNSE-OX40L能激活树突状细胞促进机体先天性免疫反应,进而增强早期抗体的产生,可以作为早期有效的狂犬病疫苗候选。 展开更多

关键词 重组狂犬病病毒 OX40L 树突状细胞 先天性免疫反应 抗体免疫

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重组狂犬病病毒抗体中和试验方法的建立 被引量：1

2

作者 姜人文 张莹辉 +5 位作者 杜吉革 李启红 朱真 陈小云 唐丽杰 印春生 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期332-338,共7页

为了构建一种使用重组狂犬病病毒的抗体中和试验方法(FAVN-GFP),将8种兽用狂犬病灭活疫苗(含标准参考疫苗)分别5倍梯度稀释4个稀释度后免疫小鼠,分别在首次免疫后的第14、28天采集小鼠血清,以表达绿色荧光蛋白的重组狂犬病病毒作为抗原... 为了构建一种使用重组狂犬病病毒的抗体中和试验方法(FAVN-GFP),将8种兽用狂犬病灭活疫苗(含标准参考疫苗)分别5倍梯度稀释4个稀释度后免疫小鼠,分别在首次免疫后的第14、28天采集小鼠血清,以表达绿色荧光蛋白的重组狂犬病病毒作为抗原,使用FAVN-GFP方法测定中和抗体效价,并与中国兽药典中的经典NIH方法进行对比分析。结果显示,首次免疫后第28天1∶25稀释组对8种疫苗的检测结果与NIH法的结果在斜率/差分上显著相关,证明在该条件下两种方法具有相同的变化趋势。结果表明,本实验所建立的FAVN-GFP法可以在兽用狂犬病灭活疫苗的效力评价中替代现有的NIH方法,能够大量减少实验动物的使用,更加安全、准确和经济。 展开更多

关键词 重组狂犬病病毒 中和试验 效力评价 灭活疫苗

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CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定 被引量：1

3

作者 文兆海 周海滢 +3 位作者 翟少华 陈凯云 胡远 简子健 《动物医学进展》 北大核心 2019年第4期21-27,共7页

为了探究CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及对小鼠的免疫效果,将CDV-N重组狂犬病病毒于BSR细胞上扩毒培养、浓缩后测定其FFD_(50)及LD_(50);将浓缩后的重组病毒液与复合佐剂按一定比例混匀,按不同免疫剂量、不同免疫方式分组免疫接种小鼠,利... 为了探究CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及对小鼠的免疫效果,将CDV-N重组狂犬病病毒于BSR细胞上扩毒培养、浓缩后测定其FFD_(50)及LD_(50);将浓缩后的重组病毒液与复合佐剂按一定比例混匀,按不同免疫剂量、不同免疫方式分组免疫接种小鼠,利用ELISA试剂盒对狂犬病、犬瘟热的特异性抗体进行定性/定量检测。结果显示,重组病毒浓缩后的FFD_(50)值为7.85logFFD_(50)/0.1 mL,LD_(50)值为7.67logLD_(50)/0.03mL;免疫接种后第14天抗体阳性率达100%,小鼠血清中的特异性抗体IgG水平随着免疫剂量的递增而递增。试验结果可为CDV-N重组狂犬病病毒制备口服弱毒疫苗的进一步研究提供试验数据。 展开更多

关键词 重组狂犬病病毒 半数荧光灶形成量 半数致死量 免疫 抗体

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表达猫衣原体momp蛋白的重组狂犬病病毒SRV9-MOMP的构建与鉴定 被引量：1

4

作者 阮晓凤 齐宇 +4 位作者 张艳艳 陈腾 周鑫涛 张守峰 扈荣良 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期904-909,共6页

为构建表达猫衣原体主要外膜蛋白(momp)的重组狂犬病病毒,以狂犬病病毒SRV9株反向遗传质粒pUC57-SRV9为骨架,在P/M基因间隔序列处插入MOMP基因,获得正确的重组全长转录质粒pUC57-SRV9-MOMP(P/M)。再将全基因组质粒与pUC57-N(SRV9)、pUC5... 为构建表达猫衣原体主要外膜蛋白(momp)的重组狂犬病病毒,以狂犬病病毒SRV9株反向遗传质粒pUC57-SRV9为骨架,在P/M基因间隔序列处插入MOMP基因,获得正确的重组全长转录质粒pUC57-SRV9-MOMP(P/M)。再将全基因组质粒与pUC57-N(SRV9)、pUC57-P(SRV9)、pUC57-G(SRV9)、pUC57-L(SRV9)4个辅助质粒共转染BSR-T7细胞系。经直接免疫荧光法验证,成功拯救出病毒SRV9-MOMP。Western-blot和RT-PCR检测表明,momp在重组病毒SRV9-MOMP感染的细胞内被稳定表达。本研究证明狂犬病病毒SRV9株具有作为载体表达外源蛋白的潜力,为研制高效、安全、经济的猫衣原体病疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 猫衣原体 主要外膜蛋白 重组狂犬病病毒

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犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救与鉴定

5

作者 文兆海 毛丽萍 +5 位作者 胡远 程瑶 周海莹 陈凯云 翟少华 简子健 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期2334-2338,共5页

探究犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救及鉴定,为后期犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒活疫苗的研制奠定基础。采用脂质体转染的方法,将纯化后的重组质粒(pcDNA-N-G-EGFP-CDVN-PM-L)与辅助性表达质粒(pcDNAN、pcDNA-G、pcDNA-P、pcDNA-L)... 探究犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救及鉴定,为后期犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒活疫苗的研制奠定基础。采用脂质体转染的方法,将纯化后的重组质粒(pcDNA-N-G-EGFP-CDVN-PM-L)与辅助性表达质粒(pcDNAN、pcDNA-G、pcDNA-P、pcDNA-L)共转染BSR细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光技术进行检测并鉴定。结果显示,对盲传至第6代、第9代病毒液进行RT-PCR检测,均出现与预期相符的目的片段(狂犬病病毒N基因片段大小为1 315bp,犬瘟热病毒CDV-N基因片段大小为1 653bp)。间接免疫荧光试验后在激光共聚焦显微镜下,试验组均可观察到大量绿色荧光表达。RT-PCR结果与间接免疫荧光试验结果相吻合,表明犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒拯救成功。 展开更多

关键词 重组狂犬病病毒 犬瘟热病毒N基因 反向遗传学 RT-PCR 间接免疫荧光

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IL-33基因重组和表达不影响重组狂犬病病毒体外表型特征

6

作者 高婷 米执中 +3 位作者 孙明 唐洗敏 王勇 李莹莹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期586-591,共6页

目的 构建白细胞介素33(IL-33)基因重组的狂犬病病毒,明确表达IL-33对重组病毒体外表型特征的影响。方法从狂犬病强毒株感染的小鼠脑内扩增获得的IL-33基因,通过反向遗传操作技术插入亲本病毒LBNSE基因组的G、 L基因之间,并拯救过表达IL... 目的 构建白细胞介素33(IL-33)基因重组的狂犬病病毒,明确表达IL-33对重组病毒体外表型特征的影响。方法从狂犬病强毒株感染的小鼠脑内扩增获得的IL-33基因,通过反向遗传操作技术插入亲本病毒LBNSE基因组的G、 L基因之间,并拯救过表达IL-33的重组病毒;将重组狂犬病毒rLBNSE-IL33和亲本毒株LBNSE感染BSR仓鼠肾细胞或NA小鼠神经瘤细胞;在感染复数=0.01的情况下,测序和荧光抗体病毒中和试验检测重组病毒在传代过程中的稳定性;检测病毒滴度病灶形成单位(FFU)绘制多步生长曲线(感染复数=0.01);细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性;ELISA检测不同感染复数感染细胞上清中IL-33的含量。结果 拯救获得过表达IL-33的rLBNSE-IL33,rLBNSE-IL33能够稳定连续传代至少10代,且毒价约为108FFU/mL;rLBNSE-IL33能够以剂量依赖的形式高水平表达IL-33,但检测被LBNSE感染的细胞上清,没有检测到IL-33的高表达;检查rLBNSE-IL33和亲本毒株LBNSE在BSR和NA细胞中5 d内的滴度,显示无明显差别,具有相似的生长动力学特性;过表达IL-33对感染细胞增殖及活性无显著影响。结论 IL-33基因重组和表达对狂犬病病毒体外表型特征无显著影响。 展开更多

关键词 白细胞介素33(IL-33) 重组狂犬病病毒rLBNSE-IL33 体外表型

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表达H3N2亚型猪流感病毒HA的重组伪狂犬病病毒对仔猪的免疫效力评价 被引量：7

7

作者 郑宝亮 田志军 +3 位作者 李若 崔红玉 仇华吉 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期115-119,共5页

利用猪流感病毒(Swineinfluenza virus,SIV)与伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)血清学阴性的4周龄断奶仔猪,对此前构建的表达SIVA/Swine/Inner Mogolian/547/2001(H3N2)血凝素(HA)基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-HA)进行了免疫效力... 利用猪流感病毒(Swineinfluenza virus,SIV)与伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)血清学阴性的4周龄断奶仔猪,对此前构建的表达SIVA/Swine/Inner Mogolian/547/2001(H3N2)血凝素(HA)基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-HA)进行了免疫效力评价。按每头105.0PFU rPRV-HA肌肉注射断奶仔猪(n=12),同时设Bartha-K61免疫对照组(n=5)和非免疫攻毒对照组(n=5)。免疫后35d用2×105.0TCID50的SIVA/Swine/Heilongjiang/74/2000(H3N2)进行强毒攻击。rPRV-HA免疫组免疫后7d均可检测到高滴度针对SIV的血凝抑制(HI)抗体,而所有对照组小猪仅在攻毒后7d才开始产生针对SIV的HI抗体;rPRV-HA免疫组在病理学保护方面明显优于对照组,支气管和肺泡冲洗液病毒分离结果显示,攻毒后7d rPRV-HA免疫组没有检测到病毒,而两个对照组可检测到病毒。以上试验结果表明,rPRV-HA免疫猪对同亚型SIV的攻击具有很好的保护作用。 展开更多

关键词 重组伪狂犬病病毒 H3N2亚型 猪流感病毒 断奶仔猪 免疫效力

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痘病毒疫苗载体 被引量：6

8

作者 庞乐君 刁天喜 《国外医学（药学分册）》 2004年第3期154-157,共4页

1798年 ,Jenner的发现奠定了免疫学的基础并最终导致天花病毒在地球上根除。尽管天花病毒已被消灭 ,在 2 0世纪 80年代仍引起一场研究痘苗病毒的高潮 ,其中部分原因是分子遗传学应用于对重组牛痘病毒外源基因的克隆和表达 ,而生物恐怖... 1798年 ,Jenner的发现奠定了免疫学的基础并最终导致天花病毒在地球上根除。尽管天花病毒已被消灭 ,在 2 0世纪 80年代仍引起一场研究痘苗病毒的高潮 ,其中部分原因是分子遗传学应用于对重组牛痘病毒外源基因的克隆和表达 ,而生物恐怖又重新引起人们对牛痘的关注。这些重组病毒在研究和疫苗学中均有多方面用途 ,并促进载体疫苗的发展 ,例如重组牛痘狂犬病疫苗在西欧及最近在美国被用来消除狂犬病 ;选择性的痘病毒载体 ,例如禽痘病毒用于非禽类动物时被证明是安全有效的非复制型载体。 展开更多

关键词 重组痘病毒载体 痘苗病毒 重组牛痘狂犬病病毒 禽痘病毒

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表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建 被引量：8

9

作者 李自力 陈焕春 +4 位作者 徐高原 方六荣 肖少波 王祥 何启盖 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期53-58,共6页

本研究以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT-PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转... 本研究以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT-PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转移载体pPgG-PrM,并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明:与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较,PrM基因的同源性为100%。以伪狂犬病病毒Ea株TK-/gG-/LacZ+突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/PrM+,为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 乙型脑炎病毒 PrM基因 重组伪狂犬病病毒

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表达多个外源基因的重组伪狂犬病病毒的构建及其细胞培养特性研究 被引量：5

10

作者 刘燕 田志军 +2 位作者 周艳君 仇华吉 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期81-85,共5页

将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有猪瘟病毒(CSFV)E2基因及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株TK基因中,通过蓝斑筛选获得了一株插入CSFV E2、PRRS... 将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有猪瘟病毒(CSFV)E2基因及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株TK基因中,通过蓝斑筛选获得了一株插入CSFV E2、PRRSV GP5与LacZ基因的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV-E2-GP5。经Westernblot、间接免疫荧光试验证实E2、GP5基因在重组病毒感染细胞中获得了表达。重组病毒感染Vero、PK-15、IBRS2和CEF细胞后的增殖滴度和致细胞病变特征与亲本病毒比较,无显著差异。本试验结果表明在PRV基因组中可以插入多个外源基因,为进一步研究多价基因工程载体疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 重组伪狂犬病病毒 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒

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伪狂犬病病毒通用转移载体的构建及应用 被引量：3

11

作者 钱平 李祥敏 +3 位作者 陈焕春 肖少波 仇华吉 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期16-20,共5页

将来自质粒pFSV40的 3 0 0bpBamHI/PstI片段〔其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点〕插入到质粒pUSK相应的酶切位点中 ,获得重组质粒pUSKSV40 ,该重组质粒中gG基因 5’端编码区缺失了 42 8bp。将来自质粒pcDNA3 .1( +)的 946bpBglIIEc... 将来自质粒pFSV40的 3 0 0bpBamHI/PstI片段〔其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点〕插入到质粒pUSK相应的酶切位点中 ,获得重组质粒pUSKSV40 ,该重组质粒中gG基因 5’端编码区缺失了 42 8bp。将来自质粒pcDNA3 .1( +)的 946bpBglIIEcoRI片段 (其中含CMV启动子及部分多克隆位点 )插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点 ,构建了通用载体pPRVCMV_uni,其中含有CMV启动子、SV40poly(A)以及NheI、Pmel、BamHI、BstXI、EcoRI、StuI、XbaI等 7个单一克隆位点。将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间 ,用所获得的转移载体与TK_/gG_/LacZ+ PRV基因组共转染PK_1 5细胞 ,经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达 ,从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。 展开更多

关键词 伪狂犬病 伪狂犬病病毒 通用转移载体 重组伪狂犬病病毒 基因工程疫苗

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重组伪狂犬病病毒(rPRV-GP5)对绵羊的安全和效力试验 被引量：3

12

作者 田志军 仇华吉 +4 位作者 孔令达 李娜 周艳君 王云峰 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期287-289,共3页

为了验证表达猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)GP5蛋白的重组伪狂犬病病毒 (rPRV_GP5 )的安全性和免疫原性 ,将 10只 5～ 6月龄健康绵羊分成三组 ,安检组 (3只 )肌注 10 8 0 PFU/只、效检组 (4只 )肌注 10 6 0 PFU/只 ,3只作为不接种对... 为了验证表达猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)GP5蛋白的重组伪狂犬病病毒 (rPRV_GP5 )的安全性和免疫原性 ,将 10只 5～ 6月龄健康绵羊分成三组 ,安检组 (3只 )肌注 10 8 0 PFU/只、效检组 (4只 )肌注 10 6 0 PFU/只 ,3只作为不接种对照组。接种后 14d ,效检组与对照组每只臀部肌注伪狂犬病病毒“双城系”猪源强毒S株 10 3 LD50 ,结果效检组全部保护 ,对照组全部死亡 ,安检组未见异常。结果表明 。 展开更多

关键词 重组伪狂犬病病毒 安全试验 效力试验

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重组伪狂犬病病毒TK^-/FMDV VP1的构建 被引量：3

13

作者 卜春玲 罗满林 +2 位作者 刘镇明 黄毓茂 贺东生 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期241-244,269,共5页

以伪狂犬病病毒 (PRV)为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。本文以广东地方分离株 (以下简称YA)为亲本株 ,用PCR方法得到同源左右臂 ,然后将重组转移载体和PRVYA的基因组共转染 ,用BUDR筛选出了表达口蹄疫病... 以伪狂犬病病毒 (PRV)为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。本文以广东地方分离株 (以下简称YA)为亲本株 ,用PCR方法得到同源左右臂 ,然后将重组转移载体和PRVYA的基因组共转染 ,用BUDR筛选出了表达口蹄疫病毒 (Foot_and_MouthDiseaseVirus ,FMDV)结构蛋白VP1的TK_重组病毒 ,用PCR和SDS -PAGE的方法对VP1蛋白进行了初步鉴定 。 展开更多

关键词 重组伪狂犬病病毒 TK基因缺失疫苗 FMDV VP1

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重组伪狂犬病病毒SA215(C)株的构建及其对小鼠的免疫原性 被引量：3

14

作者 王新 郭万柱 +5 位作者 王印 徐志文 颜其贵 朱玲 王小玉 周婷 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期407-411,共5页

为了研制猪2型圆环病毒(PCV2)基因工程疫苗,以伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失疫苗株SA215为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达PCV2ORF2基因和绿色荧光蛋白基因重组伪狂犬病病毒SA215(C)株。经PCR、Southern blotting、Western blotting等... 为了研制猪2型圆环病毒(PCV2)基因工程疫苗,以伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失疫苗株SA215为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达PCV2ORF2基因和绿色荧光蛋白基因重组伪狂犬病病毒SA215(C)株。经PCR、Southern blotting、Western blotting等证实SA215(C)构建正确,并能表达具有活性的ORF2基因蛋白和荧光蛋白。SA215(C)在IBRS-2、ST细胞中的增殖滴度与亲本株SA215相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响病毒增殖。用SA215(C)免疫BALB/c小鼠10周后检测免疫小鼠PCV2抗体和PRV中和抗体及细胞免疫反应。结果显示,SA215(C)诱导小鼠产生了PCV2和PRV抗体并出现PCV2的细胞免疫反应。另外,以105TCID50的SA215(C)株接种BALB/c小鼠,接种后28d再接种1次,2次接种后2周,用107TCID50PRVFa和PCV2强毒联合进行攻击,结果免疫小鼠抵抗住强毒的攻击,获得了保护;表明该毒株具有很强的免疫原性,为研制安全、有效的PCV2-PRV二价基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 猪2型圆环病毒 ORF2基因 重组伪狂犬病病毒

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乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建 被引量：2

15

作者 李自力 陈焕春 +3 位作者 徐高原 肖少波 王祥 何启盖 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期162-165,共4页

以乙型脑炎病毒 SA1 4 - 1 4 - 2株基因组 RNA为模板 ,采用RT- PCR一步法扩增 pr M/ E基因的全长 c DNA(约 2 kb) ,将其克隆至 p MD1 8- T载体 ,获得了克隆质粒 p Tpr M/ E,并对其进行了测序。序列分析结果表明 ,与已报道的 SA1 4 强毒... 以乙型脑炎病毒 SA1 4 - 1 4 - 2株基因组 RNA为模板 ,采用RT- PCR一步法扩增 pr M/ E基因的全长 c DNA(约 2 kb) ,将其克隆至 p MD1 8- T载体 ,获得了克隆质粒 p Tpr M/ E,并对其进行了测序。序列分析结果表明 ,与已报道的 SA1 4 强毒株和 SA1 4 - 1 4 - 2疫苗株的核苷酸比较 ,pr M基因的序列同源性为 1 0 0 %,E发生了 4个点突变 ,其中 1个为回复突变 ,并导致了 3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒 Ea株 TK- / g G- / L ac Z+突变株为载体 ,构建了 1株乙脑病毒 pr M/ E基因的重组伪狂犬病病毒 TK- / g G- / pr M/ E+。乙脑病毒 pr M/ E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建 ,为开展乙脑病毒分子生物学及猪猪伪狂犬病一乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。 展开更多

关键词 猪 乙型脑炎病毒 prM/E基因 基因克隆 重组伪狂犬病病毒 序列分析

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表达PCV-2 Cap和PPV-1 VP2蛋白的重组PRV的构建及鉴定 被引量：1

16

作者 谢永兴 夏德利 +5 位作者 黄立平 危艳武 吴洪丽 朱红振 冯力 刘长明 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第5期16-22,175,共8页

为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的VP2_(opti)... 为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的VP2_(opti)基因分别构建重组质粒pMD18T-LR(TK)-VP2_(opti)和pMD18T-LR(TK)-VP2_(opti)(SP)。用已构建的重组病毒rPRV-TK^-/gE^-/gG^-/3Cap^+为骨架,以EGFP为标签经同源重组获得重组病毒。采用IPMA法鉴定Cap蛋白和VP2蛋白抗原在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达,采用IFA法鉴定VP2蛋白在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达与定位。用这2株重组病毒免疫小鼠,通过检测血清中PRV、PCV-2和PPV-1抗体水平对构建的重组病毒在小鼠体内的免疫原性进行评价。结果表明:经同源重组获得重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+和rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+;在重组病毒感染的PK-15细胞中均能检测到阳性Cap蛋白和VP2蛋白抗原;重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆和细胞核,而重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆;用这2株重组病毒免疫小鼠能够检测到PRV中和抗体;用灭活的重组病毒免疫小鼠后可产生低水平的Cap和VP2抗体,而重组病毒活毒免疫的小鼠未检测到相应抗体。说明这2株重组病毒在体外能够表达Cap蛋白和VP2蛋白,PRV gG蛋白信号肽序列的加入促进了VP2蛋白从细胞核的释放。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 猪细小病毒1型 VP2蛋白 重组伪狂犬病病毒 重组质粒 免疫原性

原文传递

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSVN蛋白基因表达的抑制作用 被引量：2

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作者 曹素芳 王岩 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1142-1149,1153,共9页

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果。PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly... 构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果。PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA。分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HPPRRSV河南分离株HN1N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体。将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒。将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞。将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果。结果显示,PCR扩增到的CMV-siRNA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb。经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA。经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siRNAN2抑制效果最好。这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路。 展开更多

关键词 高致病性 PRRS N蛋白基因 SIRNA 重组伪狂犬病病毒

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重组伪狂犬病病毒rPRV/eGFP/rgp活疫苗免疫幼犬的最小免疫剂量及攻毒保护试验 被引量：1

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作者 袁子国 张秀香 +4 位作者 王晓虎 徐慧娟 张守峰 刘云方 扈荣良 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2008年第8期92-94,共3页

关键词 重组伪狂犬病病毒 保护试验 最小免疫剂量 疫苗免疫 EGFP β-半乳糖苷酶 攻毒 幼犬

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靶向HP-PRRSV ORF7基因的siRNA重组伪狂病病毒的体外复制抑制效果 被引量：1

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作者 曹素芳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期2044-2050,共7页

为了评价靶向高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）ORF7的siRNA重组伪狂犬病病毒（rPRV）对HP-PRRSV复制的体外抑制效果。将500MOI的siRNA rPRV：rPRV gG-/siRNA N1、rPRV gG-/siRNA N2、rPRV gG-/siRNA N3分别感染Marc-145细胞,... 为了评价靶向高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）ORF7的siRNA重组伪狂犬病病毒（rPRV）对HP-PRRSV复制的体外抑制效果。将500MOI的siRNA rPRV：rPRV gG-/siRNA N1、rPRV gG-/siRNA N2、rPRV gG-/siRNA N3分别感染Marc-145细胞,24h后再分别接种10 MOI PRRSV,感染病毒48h后,观察其抑制HPPRRSV HN1株复制效果;待细胞感染病毒72h后,应用间接免疫荧光试验（IFA）、实时荧光定量PCR及Western blot检测重组rPRV介导的siRNA对HP-PRRSV在细胞中复制的抑制作用。结果显示,与表达突变siRNA的rPRV gG-/siRNA Neg及接毒对照组相比,HP-PRRSV在细胞中的复制均可被3个siRNA rPRV有效抑制,其中重组病毒rPRV gG-/siRNA N2抑制效果最佳;进一步检测siRNA重组rPRV在Marc-145细胞中抑制HP-PRRSV HN1株的复制效果,结果显示,与对照组相比,重组病毒rPRV gG-/siRNA N1和rPRV gG-/siRNA N3抑制作用不明显,而rPRV gG-/siRNA N2不但能够有效抑制HP-PRRSV引起的细胞病变,而且能够消减HP-PRRSV N蛋白的表达,明显降低ORF7mRNA的表达水平（P〈0.05）,且其抑制作用具有剂量依赖性,其抑制效果至少可持续5d,但随着时间的延长逐渐减弱。结果提示siRNA rPRV在体外能抑制HP-PRRSV的复制。 展开更多

关键词 高致病性PRRSV 重组伪狂犬病病毒 RNA干扰 SIRNA

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表达PRRSV NADC30-like毒株GP5-M的重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性探究

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作者 孙珊珊 其美拉姆 +4 位作者 李强 曾南方 郑诚 张白玉 颜其贵 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第11期2555-2567,共13页

为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株,以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为... 为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株,以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体,以gI/gE基因为插入靶点,利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因,并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒,经噬斑纯化,成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明,该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性,易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索,同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。 展开更多

关键词 GP5-M蛋白 重组伪狂犬病病毒 CRISPR/Cas9 生物学特性

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