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α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究 被引量:3
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作者 刁文涛 向凌云 +5 位作者 宁萌 王雪妍 马焕 冯菲 陈国参 周伏忠 《中国酿造》 CAS 北大核心 2019年第8期60-66,共7页
利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,成功异源表达了一株链球菌(Streptococcus)S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最... 利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,成功异源表达了一株链球菌(Streptococcus)S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50℃,在碱性环境中(pH 7.5~10.0)及在40℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷(pNPG)的最大水解速率(Vmax)为508.38μmol/(min·mg),米氏常数(Km)值为1.2 mmol/L;通过薄层层析(TLC)法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。 展开更多
关键词 链球菌 大肠杆菌 异源表达 重组α-糖苷酶 学性质
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新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究 被引量:2
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作者 高红伟 李素波 +5 位作者 艾雪 李妙 王颖丽 让文亮 季守平 宫锋 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期201-204,共4页
观察脆弱类杆菌来源的新型重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性。在有选择压力(Kan+)条件下,将重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素... 观察脆弱类杆菌来源的新型重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性。在有选择压力(Kan+)条件下,将重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、平板传代及诱导过程中的质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力检测。结果表明细菌形态、生长速度和抗生素抗性等与原始种子库无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100%,但诱导过程中质粒易丢失。第20、40和60代提取质粒进行酶切检查,酶切图谱没有改变。DNA测序未见α-半乳糖苷酶基因变异。原代菌株及第20、40和60代菌株经诱导培养,其α-半乳糖苷酶表达水平、酶活力及菌体蛋白的SDS-PAGE图谱均无明显差异。 展开更多
关键词 重组α-糖苷酶 遗传稳定性 传代
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B→O blood conversion 被引量:2
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作者 ZGHANYangpei LANJiongcai 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 2003年第3期269-273,共5页
To maintain a constant supply of universal blood type, or group O red blood cells, has benefit in specialized transfusion condition. In this study, a-galactosidase cDNA was cloned from Catimor coffee bean grown in Hai... To maintain a constant supply of universal blood type, or group O red blood cells, has benefit in specialized transfusion condition. In this study, a-galactosidase cDNA was cloned from Catimor coffee bean grown in Hainan island, China, by the RT-PCR method. We have constructed a vector for a-galactosidase cDNA expression and transferred a-galactosidase cDNA into Pichia pastoris GS115 cells by elec-troporation. The recombinant a-galactosidase (r-a-GalE) was purified by cation ion exchange chromatography. After studying the biochemical characters of r-a-GalE, we have succeeded in converting human erythrocytes from group B to group O. The animal experiment showed that transfusion of enzymetically converted group O red blood cells (ECORBC) was perfectly safe. 展开更多
关键词 红细胞血型 B型 血型转化 O型 重组α-糖苷酶
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重组血型改造工具酶稳定性的研究
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作者 高红伟 金泗虎 +6 位作者 王玲燕 李素波 檀英霞 鲍国强 徐丽娟 章扬培 宫锋 《中国输血杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期244-246,共3页
目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-7... 目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-70℃分别保存6个月,定期取样观察样品的外观,检测样品的pH值、纯度、酶活性,并进行无菌试验;为确保临床使用中的安全性和有效性,我们对4℃保存的样品进行了长达3年的观察。结果重组α-半乳糖苷酶在70℃保存1d后失活,37℃保存2个月后活性降低了11.5%,室温保存6个月后活性降低了19%,-70℃保存6个月后活性降低了13%,4℃、-20℃保存的样品6个月内各项指标均正常,均未见蛋白明显降解,蛋白活性保持稳定。4℃保存3年的样品酶活性保持稳定,可按原剂量在26℃,2h内成功地将B型红细胞改造成O型红细胞。结论重组α-半乳糖苷酶对热不稳定,应保存4℃或-20℃,在此条件下,有效期至少2年,能满足常规临床要求。 展开更多
关键词 重组α-糖苷酶 稳定性 活性测定 血型改造
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原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究 被引量:12
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作者 高红伟 李素波 +6 位作者 鲍国强 檀英霞 王玲燕 金泗虎 王颖丽 季守平 宫锋 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2011年第2期503-507,共5页
本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷... 本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化。利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞。结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D600为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时。纯化后α-半乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg。该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞。结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶。 展开更多
关键词 基因重组α-糖苷酶 血型改造 B→O血型改造
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重组α-半乳糖苷酶消除大豆低聚糖引起的小鼠肠胃胀气的研究 被引量:4
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作者 王璇琳 李素波 章扬培 《营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期434-437,共4页
目的:分析食用大豆及其制品中的低聚糖引起肠胃胀气的原因。基因重组α-半乳糖苷酶对棉籽糖和水苏糖进行酶解,低聚糖对小鼠肠胃胀气的缓解情况。方法:以棉籽糖和水苏糖标准品作为受试物,分别灌胃给予不同周龄的昆明种小鼠,分析棉籽糖和... 目的:分析食用大豆及其制品中的低聚糖引起肠胃胀气的原因。基因重组α-半乳糖苷酶对棉籽糖和水苏糖进行酶解,低聚糖对小鼠肠胃胀气的缓解情况。方法:以棉籽糖和水苏糖标准品作为受试物,分别灌胃给予不同周龄的昆明种小鼠,分析棉籽糖和水苏糖是否引起小鼠肠胃胀气;通过测量小鼠胀肠容积的方法检测胀气情况;硅胶薄层层析(TLC)检测低聚糖;SDS-PAGE法检测大豆蛋白。结果:棉籽糖、水苏糖均能够引起小鼠肠胃胀气;基因重组α-半乳糖苷酶可以消除小鼠食用棉籽糖和水苏糖后的肠胃胀气现象,添加的α-半乳糖苷酶对大豆蛋白没有影响。结论:α-半乳糖苷酶可做为食品添加剂,用来解决食用豆制品时发生的肠胃胀气。 展开更多
关键词 肠胃胀气 棉籽糖 水苏糖 基因重组α-糖苷酶
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重组α-半乳糖苷酶酶解大豆低聚糖研究 被引量:3
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作者 王璇琳 李素波 +3 位作者 高红伟 田曙光 宫锋 章扬培 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第12期222-226,共5页
本研究应用本实验室基因重组咖啡豆α-半乳糖苷酶对棉籽糖和水苏糖进行了酶解,应用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法检测了酶解前后大豆低聚糖的变化情况,结合大豆制品传统加工工艺,提出了酶的添加方式和工艺。
关键词 大豆低聚糖 肠胃胀气 基因重组α-糖苷酶
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罕见病酶替代疗法药物重组人α-半乳糖苷酶A酶活性测定方法研究
8
作者 王绿音 张孝明 +1 位作者 李晶 梁成罡 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期738-744,共7页
目的基于酶反应动力学理论对重组人α-半乳糖苷酶A(recombinant humanα-galactosidase A,rhα-GAL)酶活性测定反应条件进行系统研究,建立更灵敏简便、准确稳定的rhα-GAL酶活性测定方法。方法优化反应体系后的最适条件为:以50 mmol... 目的基于酶反应动力学理论对重组人α-半乳糖苷酶A(recombinant humanα-galactosidase A,rhα-GAL)酶活性测定反应条件进行系统研究,建立更灵敏简便、准确稳定的rhα-GAL酶活性测定方法。方法优化反应体系后的最适条件为:以50 mmol·L^(-1)对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷的为底物,酶质量浓度为1.67μg·mL^(-1),于37℃水浴准确反应15 min后,加入甘氨酸缓冲液(pH10.5)终止反应,采用酶标仪在400 nm波长处测定产物对硝基苯酚的光密度值。结果该方法专属性良好,rhα-GAL在(0.83~2.51 mg·mL^(-1))(r=0.9998)质量浓度范围内与酶促反应速率呈良好的线性关系;rhα-GAL在50%、80%、100%、125%及150%浓度水平验证溶液的回收率在94.2%~101.8%范围内(n=18),测定结果的变异系数(CV)在2.0%~5.5%(n=18);同一份供试品溶液的12次独立测定结果的CV为2.21%;考察反应体系中的水浴温度、反应时间和底物浓度微小变化对测定结果的影响,结果表明方法的耐用性较好;复溶后的样品于2~8℃存放48 h稳定性较好;水解产物对硝基苯酚在(0.01~0.15 mmol·L^(-1))(r=0.9997)范围内与光密度呈良好的线性关系,5个浓度水平的回收率在94.9%~105.1%之间(n=9),CV均小于2%(n=9);采用该法分析2个已上市产品的酶活性。结论建立了生色底物法测定rhα-GAL的酶活性,该方法灵敏度高、精密度及准确度较好,可用于rhα-GAL产品的酶活性评价和质量控制。 展开更多
关键词 罕见病用药 替代疗法 重组α-糖苷酶A 活性测定 生色底物法 方法验证
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重组人α-半乳糖苷酶在悬浮CHO-S细胞中的表达、纯化及功能活性鉴定 被引量:1
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作者 邓木兰 周泓宇 +7 位作者 郑可欣 李昭阳 郭婉怡 王艳苹 梁志成 李芳红 穆云萍 赵子建 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期774-781,共8页
目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖... 目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide, Gb3 or GL3)的清除效果。方法 构建人α-半乳糖苷酶基因gla融合6×His标签的表达载体pcDNA4-GLA,将其转染至悬浮CHO-S细胞中,表达纯化并检测rhα-Gal A糖基化形式、表达量及酶活性;通过与人皮肤成纤维细胞共孵育,观察rhα-Gal A是否能被摄取到胞内并有效清除Gb3。结果 研究结果显示,rhα-Gal A成功在CHO-S细胞中表达,表达量最高可达(100±20.6) mg·L^(-1),且rhα-Gal A被糖基化修饰,酶活与商品酶Fabrazyme酶活相近,为(59±9.1) kU·g^(-1);此外,rhα-Gal A能被有效摄取到人成纤维细胞胞内并靶向溶酶体进而有效清除Gb3。结论 利用瞬时转染技术在悬浮CHO-S细胞中成功表达并纯化出rhα-Gal A,具有良好的生物学活性且可有效清除Gb3,为我国法布雷病的酶替代疗法提供新的选择。 展开更多
关键词 重组α-糖苷酶 法布雷病 替代疗法 悬浮CHO-S细胞 体贮积症 基因工程
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应用昆虫体生产乳糖酶的纯化方法及理化性质的研究
10
作者 许琳 蓝德安 +4 位作者 胡洁泓 龙綮新 王珣章 杨璐 庞义 《中山大学学报论丛》 1995年第2期106-111,159,共7页
本文将已构建好的带有乳糖酶基因的杆状病毒(AcNPV p10 Z-9)作为载体,经口服感染人工饲养的银纹夜蛾(Argyrogra(?) agnata)幼虫,在昆虫体内高效表达乳糖酶蛋白,表达水平可占虫体可溶性蛋白的20%。将虫匀浆后,经高速离心、丙酮沉淀及冷... 本文将已构建好的带有乳糖酶基因的杆状病毒(AcNPV p10 Z-9)作为载体,经口服感染人工饲养的银纹夜蛾(Argyrogra(?) agnata)幼虫,在昆虫体内高效表达乳糖酶蛋白,表达水平可占虫体可溶性蛋白的20%。将虫匀浆后,经高速离心、丙酮沉淀及冷冻干燥等方法,即可制备成粗酶。进一步经FPLC β-aminophenyl-β-D-thiogalactopyranoside亲和柱层析方法制备成精制酶,可作为试剂及药物应用.经测定纯化后的酶比活为150000u/mg蛋白。酶活力的最适pH值是6.0~8.0,最适温度为30~40℃。该酶水解对硝基苯-β-D-半乳糖(ONPG)的米氏常数(Km)值为7.14×10^(4)mol/L,乳糖可竞争性地抑制乳糖酶水解ONPG的能力,Ki值为1.30×10^(-3)mol/L。 展开更多
关键词 重组β-D-糖苷酶 昆虫杆状病毒系统 纯化 理化性质
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重组α-半乳糖苷酶A替代治疗法布里病的安全性和有效性 被引量:1
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作者 CQS 《中华医学信息导报》 2001年第18期22-22,共1页
据《N Eng1 J Med》2001年345卷第1期报道 法布里(Fabry’S)病为溶酶体α-半乳糖苷酶A缺乏症,由于N-脂酰鞘氨醇三己糖苷(globotriaosylceramide)及相关的糖鞘脂(glycosphingolipids)进行性积聚而引起,受累病人有肾脏、心脏和脑微血管病变。
关键词 法布里病 替代治疗 α-糖苷酶A缺乏症 重组α-糖苷酶A
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糖原贮积症Ⅱ型诊断及特异性治疗研究现状
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作者 王盼 刘颖超 钱素云 《中华实用儿科临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期65-68,共4页
糖原贮积症Ⅱ型(GSDⅡ)是一种罕见的常染色体隐性遗传病。婴儿型患者常存在进行性心肌肥厚、肌无力, 最终死于心肺功能衰竭。该病主要通过酶学及基因学检测进行筛查及确诊。酶替代治疗为该病目前唯一获得批准的治疗方式, 可有效改善患... 糖原贮积症Ⅱ型(GSDⅡ)是一种罕见的常染色体隐性遗传病。婴儿型患者常存在进行性心肌肥厚、肌无力, 最终死于心肺功能衰竭。该病主要通过酶学及基因学检测进行筛查及确诊。酶替代治疗为该病目前唯一获得批准的治疗方式, 可有效改善患者受累器官功能, 提高生存率。基因疗法、底物减少疗法等也在进行基础或临床研究。现总结近年来国内外GSDⅡ的诊治研究现状, 重点对特异性治疗尤其酶替代治疗的疗效影响因素、给药方案、提高疗效方式等进行综述。 展开更多
关键词 糖原贮积症Ⅱ型 庞贝病 替代治疗 基因治疗 重组α-葡萄糖苷酶
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婴儿型庞贝病1例护理
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作者 王珉涛 周霞 《上海护理》 2022年第8期74-76,共3页
庞贝病(又称为糖原累积病Ⅱ型)是一种常染色体隐性遗传病,其特征是溶酶体酸性α-葡糖苷酶(acid alpha-glucosidase,GAA)基因突变导致GAA酶活性降低或缺乏,糖原不能分解而贮积在各种组织的溶酶体内,导致心肌、呼吸肌及骨骼肌等进行性损害... 庞贝病(又称为糖原累积病Ⅱ型)是一种常染色体隐性遗传病,其特征是溶酶体酸性α-葡糖苷酶(acid alpha-glucosidase,GAA)基因突变导致GAA酶活性降低或缺乏,糖原不能分解而贮积在各种组织的溶酶体内,导致心肌、呼吸肌及骨骼肌等进行性损害,以及各种神经功能损害[1]。根据临床症状出现的时间,该病可分成婴儿型庞贝病(infantile-onset Pompe disease,IOPD)和晚发型庞贝病(late-onset Pompe disease,LOPD)。IOPD患儿病情进展迅速,绝大多数患儿表现为肥厚性心肌病、心脏肿大、肌肉无力及呼吸功能不全,若无有效治疗,常于1岁左右死于心力衰竭及呼吸衰竭[2]。 展开更多
关键词 庞贝病 糖原累积病Ⅱ型 替代疗法 重组人类α-葡糖苷酶 护理
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晚发型蓬佩病的酶治疗随访及相关文献复习 被引量:1
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作者 曾燕华 吴昭英 +3 位作者 李红芳 邹慧敏 陈芸 郝延磊 《中华神经科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期677-685,共9页
目的总结分析酶治疗对晚发型蓬佩病患者的疗效及安全性,为晚发型蓬佩病患者的治疗及预后提供参考。方法总结济宁医学院附属医院于2019年5月13日收治的1例确诊的晚发型蓬佩病患者的临床特点,观察其对α-葡糖苷酶(GAA)治疗的疗效。同时检... 目的总结分析酶治疗对晚发型蓬佩病患者的疗效及安全性,为晚发型蓬佩病患者的治疗及预后提供参考。方法总结济宁医学院附属医院于2019年5月13日收治的1例确诊的晚发型蓬佩病患者的临床特点,观察其对α-葡糖苷酶(GAA)治疗的疗效。同时检索有关酶治疗晚发型蓬佩病文献,最终纳入21篇文献910例晚发型蓬佩病患者进行分析。结果患者16岁后逐渐出现肌无力的表现,GAA活力为0,肌电图提示双下肢肌源性损害,二代测序发现GAA基因的复合杂合突变,肌肉活组织检查提示空泡样特征性改变。患者诊断蓬佩病8年后给予酶治疗18.5个月,共治疗20次,肌无力症状前期有改善,且未出现不良反应。对纳入的行GAA治疗的910例晚发型蓬佩病患者进行分析,大部分患者在使用GAA治疗后,行走能力和(或)呼吸功能改善或稳定。结论酶治疗可以延缓大部分晚发型蓬佩病患者的病情进展,提高生活质量,且耐受性良好;在晚期重症患者中,即使在发病多年后行酶治疗,依然有显著疗效。 展开更多
关键词 糖原贮积病Ⅱ型 替代疗法 重组酸性α-葡糖苷酶
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婴儿型糖原贮积症Ⅱ型酶替代治疗三例并文献复习 被引量:3
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作者 徐玲玲 巴宏军 +7 位作者 李素萍 梁玉坚 黄雪琼 张丽丹 裴瑜馨 黄慧敏 张成 唐雯 《中国全科医学》 CAS 北大核心 2019年第27期3377-3382,共6页
背景婴儿型糖原贮积症Ⅱ型(GSDⅡ)患儿临床表现危重,未予重组人酸性α葡糖苷酶替代治疗时,常会在1岁前死于心力衰竭和或呼吸衰竭,目前国内缺少对婴儿型GSDⅡ酶替代治疗的疗效评估。目的总结婴儿型GSDⅡ使用重组α葡萄糖苷酶治疗的效果,... 背景婴儿型糖原贮积症Ⅱ型(GSDⅡ)患儿临床表现危重,未予重组人酸性α葡糖苷酶替代治疗时,常会在1岁前死于心力衰竭和或呼吸衰竭,目前国内缺少对婴儿型GSDⅡ酶替代治疗的疗效评估。目的总结婴儿型GSDⅡ使用重组α葡萄糖苷酶治疗的效果,为临床治疗提供参考。方法收集2016年3月—2017年12月在中山大学附属第一医院住院确诊的婴儿型GSDⅡ患儿3例,均有心肌肥厚和/或肌无力表现,外周血酸性α-葡糖苷酶(GAA)活性低于正常。患儿均接受重组人类GAA替代治疗,20mg/kg,1次/2周。观测患儿生命体征、呼吸情况、肌力、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、胸部X线检查情况。结果3例患儿开始治疗时症状均以四肢肌无力并呼吸困难为主要表现,1例成功撤离呼吸机,2例放弃治疗后死亡。3例患儿经重组人类GAA替代治疗肌力均明显好转,ALT下降2例,升高1例;AST下降2例,升高1例;LDH下降1例,升高2例;CK下降2例,升高1例;3例患儿治疗前的胸部X线检查示心影大;治疗后患儿1、2胸部X线检查示心影缩小,患儿3胸部X线检查示心影变化不明显。治疗后心脏彩超示室间隔厚度下降3例;左心室射血分数提升3例。结论 结合文献复习,重组人GAA替代治疗婴儿型GSDⅡ安全有效,可明显改善患儿心功能、肌力及呼吸功能。 展开更多
关键词 糖原贮积病Ⅱ型 婴儿 替代疗法 体贮积病 重组人酸性α-葡糖苷酶 神经肌肉疾病
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