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反义金属蛋白酶抑制因子-1对肝星形细胞的影响 被引量：1
1
作者 刘文滨 王吉耀 +4 位作者 杨长青 王逸青 蒋炜 贺伯明 郭津生 《中华消化杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期7-10,共4页
目的　探讨体外构建的反义金属蛋白酶组织抑制因子 (TIMP 1)表达质粒在大鼠肝星形细胞 (HSC)中的表达情况及对HSC活化后Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响。方法　双酶灌注和梯度离心法分离正常大鼠HSC ,培养 7～ 10d后活化为肌成纤维样母细胞表型... 目的　探讨体外构建的反义金属蛋白酶组织抑制因子 (TIMP 1)表达质粒在大鼠肝星形细胞 (HSC)中的表达情况及对HSC活化后Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响。方法　双酶灌注和梯度离心法分离正常大鼠HSC ,培养 7～ 10d后活化为肌成纤维样母细胞表型。应用巢式RT PCR和基因重组技术构建能在真核细胞中表达的反义TIMP 1质粒并测序鉴定。应用脂质体介导重组质粒和 pcDNA3空质粒转染HSC ,经含 40 0 μg/mlG418的DMEM培养液筛选 3～ 4周 ,另设立空白对照组。Northernblot和Westernblot检测筛选后的HSC中TIMP 1表达情况 ;用FITC标记的Ⅰ型胶原为底物测定培养上清液内间质胶原酶活性 ;应用Westernblot方法对HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原进行半定量分析。结果　外源重组质粒能较大程度地抑制活化HSC中TIMP 1的表达 ,而pcDNA3空质粒和空白对照组则无类似结果。TIMP 1/GAPDH比值分别为 0 .67,2 .41和 2 .97(mRNA水平 ,P <0 .0 5)。TIMP 1/ β actin比值分别为0 .3 1,0 .98和 1.3 2 (蛋白质水平 ,P <0 .0 5)。外源重组质粒转染显著提高了间质胶原酶活性 ,酶活性分别为 0 .3 0 49,0 .14 11和 0 .1196(P <0 .0 5)。HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原量明显减少。Ⅰ型胶原 / β actin比值分别为 0 .63 ,1.78和 1.92 (P <0 .0 5)。Ⅲ型胶原 / β 展开更多
关键词 反义金属蛋白酶抑制因子-1 肝星形细胞 胶原 酶灌注法 梯度离心法 基因重组技术 细胞外基质 肝纤维化
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胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较 被引量：1
2
作者 任文洁 林哲绚 《汕头大学医学院学报》 2022年第4期204-209,共6页
目的:胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较。方法:改良Seglen两步灌注法,选用胰蛋白酶和胶原酶D分别对同批生长的10~16周C57BL/6J雄性小鼠进行在体灌注分离肝实质细胞,比较分离肝细胞的存活率、纯度、形态、活性、获取... 目的:胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较。方法:改良Seglen两步灌注法,选用胰蛋白酶和胶原酶D分别对同批生长的10~16周C57BL/6J雄性小鼠进行在体灌注分离肝实质细胞,比较分离肝细胞的存活率、纯度、形态、活性、获取数量等。结果:两种方法分离得到的小鼠原代肝细胞的存活率和纯度均达到90%以上,且在形态学上无明显差异,不同培养时间的细胞活性基本一致。胶原酶灌注法所得到的细胞数量多于胰蛋白酶灌注法。结论:胰蛋白酶和胶原酶灌注法均适用于分离提取小鼠原代肝细胞,可根据实验条件选择不同的灌注方法。 展开更多
关键词 酶灌注法 小鼠原代肝细胞 胰蛋白酶 胶原酶
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激活素A对肝星状细胞细胞外基质合成的影响 被引量：6
3
作者 刘清华 李定国 +5 位作者 黄新 尤汉宁 潘勤 徐雷鸣 徐芹芳 陆汉明 《世界华人消化杂志》 CAS 2003年第6期745-748,共4页
目的:探讨激活A(activin A,ACTA)对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成的影响。方法:采用原位酶灌注法和密度梯度离心法分离HSC,初次传代后,HSC随机分为8组:空白对照组(A组)、ACTA1μg/L... 目的:探讨激活A(activin A,ACTA)对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成的影响。方法:采用原位酶灌注法和密度梯度离心法分离HSC,初次传代后,HSC随机分为8组:空白对照组(A组)、ACTA1μg/L组(B组)、ACTA10μg/L组(C组)、ACTA100μg/L组(D组)、TGFβ_1 10μg/L组(E组)、ACTA1μg/L+TGFβ_1 10μg/L组(F组)、ACTA 10μg/L+TGF β_1 10μg/L组(G组)、ACTA 100μg/L+TGF β_1 10μg/L组(H组),加药后24h,采用放射免疫法检测培养液Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原含量及半定量RT-PCR方法测定细胞Ⅲ型胶原mRNA表达。结果:ACTA能刺激体外培养HSC分泌ECM,在一定浓度范围内(1-100μg/L)呈剂量依赖关系;100μg/L ACTA刺激HSC分泌ECM的能力与10μg/L TGF-β_1相当,而且ACTA能协同TGF-β_1发挥这一生物学效应。结论:激活素A参与肝纤维化形成。 展开更多
关键词 激活素A 肝星状细胞 细胞外基质 合成 原位酶灌注法 密度梯度离心法 肝纤维化
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血管紧张素Ⅱ对大鼠HSC合成PAI-I的影响及NO的干预作用 被引量：3
4
作者 张晶 李定国 +3 位作者 尤汉宁 刘清华 宗春华 陆汉明 《世界华人消化杂志》 CAS 2003年第11期1807-1808,共2页
目的:明确血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠肝星形细胞(HSC)细胞外基质降解的影响以及一氧化氮(NO)对其的干预作用.方法:采用原位酶灌注法分离培养 HSC,发色底物法测定纤溶酶原激活物抑制物-I(PAI-I)活性,硝酸还原酶法测定NO 浓度;采用半定量 ... 目的:明确血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠肝星形细胞(HSC)细胞外基质降解的影响以及一氧化氮(NO)对其的干预作用.方法:采用原位酶灌注法分离培养 HSC,发色底物法测定纤溶酶原激活物抑制物-I(PAI-I)活性,硝酸还原酶法测定NO 浓度;采用半定量 RT-PCR 法检测 PAI-I mRNA 的表达.结果:AngⅡ能剂量依赖性地促进 HSC 合成和释放 PAI-I,NO、依那普利和氯沙坦均能减弱这种作用.结论:AngⅡ能通过Ⅰ型受体抑制细胞外基质降解,NO 可以拮抗这种作用.促进细胞外基质代谢是依那普利和氯沙坦抑制肝纤维化的机制之一. 展开更多
关键词 血管紧张素Ⅱ 大鼠 肝星形细胞 细胞外基质 原位酶灌注法 发色底物法 一氧化氮 依那普利 氯沙坦 肝纤维化
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原代肝星状细胞分离方法新进展
5
作者 孔洋洋 刘立新 《中华消化病与影像杂志（电子版）》 2017年第3期125-128,共4页
肝星状细胞(HSCs)又称储脂细胞、Ito细胞,是肝脏固有非实质细胞类型之一,在肝脏细胞中所占比例不到8%。它存在于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的Disse间隙内,并以脂滴的形式储存人体维生素A。HSCs是细胞外基质的主要来源,它的活化是肝纤维... 肝星状细胞(HSCs)又称储脂细胞、Ito细胞,是肝脏固有非实质细胞类型之一,在肝脏细胞中所占比例不到8%。它存在于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的Disse间隙内,并以脂滴的形式储存人体维生素A。HSCs是细胞外基质的主要来源,它的活化是肝纤维化发生发展过程中的关键环节。原代HSCs分离方法的研究是进行肝纤维化发生机制研究的基础,是肝纤维化研究的热点之一。目前关于HSCs的分离方法有经典的肝脏二步酶灌注法、流式细胞术分选法、磁珠分选法等,本文就近年来原代HSCs分离方法新进展进行综述。 展开更多
关键词 肝星状细胞 细胞分离 二步酶灌注法 流式细胞术分选法 磁珠分选法
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