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多基因共表达载体的构建策略 被引量:32
1
作者 曹慧青 丁金凤 《国外医学(分子生物学分册)》 CSCD 2002年第1期1-4,共4页
于同一载体上同时表达多个外源基因在生物学领域中有广泛的应用价值 ,尤其在针对疾病发生发展的各个环节设计的联合基因治疗方案中 ,构建合适的载体获得多个外源基因的高效转移与表达具有重要意义。目前可提供的载体难以满足这一要求。... 于同一载体上同时表达多个外源基因在生物学领域中有广泛的应用价值 ,尤其在针对疾病发生发展的各个环节设计的联合基因治疗方案中 ,构建合适的载体获得多个外源基因的高效转移与表达具有重要意义。目前可提供的载体难以满足这一要求。近年来在多顺反子表达载体的构建策略方面有许多新的进展 。 展开更多
关键词 基因表达 调控 遗传载体 构建 多基因共表达载体
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人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达 被引量:17
2
作者 夏小兵 成军 +5 位作者 王刚 杨继珍 刘妍 董菁 王琳 李克 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第7期743-746,共4页
目的从人胎肝cDNA文库中克隆出人肝再生增强因子(human augmenter of liver,regeneration,hALR),并实现hALR在毕赤酵母中的表达方法利用PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,亚克隆到pPIC9K的α因子下游并置于AOX1... 目的从人胎肝cDNA文库中克隆出人肝再生增强因子(human augmenter of liver,regeneration,hALR),并实现hALR在毕赤酵母中的表达方法利用PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,亚克隆到pPIC9K的α因子下游并置于AOX1启动子控制下,构建成含有ALR基因的酵母表达载体转化酵母细胞后,挑选出能在浓度为4.0g·L^(-1)的G418平板上生长的His^+的重组酵母,利用PCR鉴定是否插入了hALR基因.重组酵母的表达在甲醇培养中进行,并利用SDS-PAGE分析hALR的表达.结果 PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,实现了其在酵母中的整和表达结论 hALR在毕赤酵母中的表达是可行的. 展开更多
关键词 人肝再生增强因子 肝再生 肝细胞生长因子 遗传 毕赤酵母 基因表达 遗传载体
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新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建 被引量:14
3
作者 徐容 潘卫 +6 位作者 沈毅 陈秋莉 潘欣 冯春芝 戚中田 刘彦君 邓松华 《安徽医科大学学报》 CAS 2004年第2期83-86,共4页
目的 进一步改造噬菌体展示载体 ,使之能更有效地展示各种外源随机多肽文库。方法 以 pCANTAB5X IFN α2b重组质粒为模板 ,在上游引物中引入XbaⅠ、SacⅠ酶切位点 ,在下游引物中引入SacⅠ、StuⅠ、SalⅠ酶切位点 ,将用该引物扩增的IFN... 目的 进一步改造噬菌体展示载体 ,使之能更有效地展示各种外源随机多肽文库。方法 以 pCANTAB5X IFN α2b重组质粒为模板 ,在上游引物中引入XbaⅠ、SacⅠ酶切位点 ,在下游引物中引入SacⅠ、StuⅠ、SalⅠ酶切位点 ,将用该引物扩增的IFN α2b衔接片段PCR产物克隆到pMD18 T中 ,再将该片段用XbaⅠ和SalⅠ酶切并将之插入pCANTAB5L的XbaⅠ和SalⅠ位点中 ,经SacⅠ酶切 ,线性载体片段自连 ,构成新型噬菌体展示载体 pCANTAB5S。 结果 限制酶切位点SacⅠ被引入到噬菌体展示载体 ,并校正了pCANTAB5L载体StuⅠ、SalⅠ等位点的读框。结论 成功构建了含读框正确的SacⅠ等多个克隆位点的新型噬菌体展示载体pCANTAB5S ,可用于各种外源随机多肽文库的有效展示。 展开更多
关键词 噬菌体 pCANTAB5S 遗传 质粒 遗传载体 肽库
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HCVC基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-C的构建、鉴定及表达 被引量:15
4
作者 郝春秋 周永兴 +3 位作者 冯志华 李谨革 贾战生 王平忠 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第6期635-639,共5页
目的构建能表达HVC基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCVC基因的腺病毒载体做准备。方法用分别含有BgⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVC区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PC... 目的构建能表达HVC基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCVC基因的腺病毒载体做准备。方法用分别含有BgⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVC区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCVC区基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd,CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-C通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定,以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-C在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd,HCV-C插入片段为HCVC区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论构建的质粒pAd.HCV-C可以在7721细胞中瞬时表达HCVC区基因,为包装表达HCVC基因的腺病毒载体奠定了基础。 展开更多
关键词 C型肝炎样病毒属 遗传 病毒基因 腺病毒科 遗传载体
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双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究 被引量:12
5
作者 吴赤红 曾争 +1 位作者 王勤环 于敏 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第10期605-608,共4页
目的 探讨表达乙型肝炎病毒 (HBV)双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒 ,转染PA317细胞 ,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度 ,以假病毒颗粒感... 目的 探讨表达乙型肝炎病毒 (HBV)双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒 ,转染PA317细胞 ,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度 ,以假病毒颗粒感染 2 2 15细胞 ,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测 2 2 15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显 ,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大 ,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用 ,双靶区反义RNA作用更明显。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 反义RNA 遗传载体 实验研究 双靶区 基因治疗
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腺病毒载体研究进展与展望 被引量:7
6
作者 韦芳 黄倩 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期506-509,共4页
基因治疗自1990年第一个基因治疗方案在美国被批准进入临床试验以来,一直在稳步发展.据不完全统计,目前在全世界范围内已有918个基因治疗方案进入临床试验,特别是在疑难疾病的治疗方面显示出巨大的应用潜力.
关键词 肿瘤 腺病毒 遗传载体 基因疗法
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人胃癌细胞端粒酶RNA组分hTR基因片段的克隆及其正反义真核表达载体的构建 被引量:11
7
作者 冯润华 李建芳 +2 位作者 刘炳亚 朱正纲 尹浩然 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第12期1409-1414,共6页
目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列。将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后... 目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列。将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分(hTR)基因正义真核表达载体(pEF-hTR)。随后采用EcoRV和SpeⅠ从pEF-hTR上切下该目的基因片段并反向插入pBluescriptⅡKS载体上的EcoRV/SpeⅠ酶切位点上。最后采用KpnⅠ和NotⅠ从pBluescriptⅡKS载体上切下该目的基因片段并正向插入pEF-hTR的KpnⅠ/NotⅠ酶切位点上从而构建出人端粒酶RNA组分(hTR)基因反义真核表达载体(pEF-ahTR)。对所构建的载体均进行酶切鉴定和测序确认。结果所克隆的基因片段其碱基序列与文献报道完全一致,且插入载体的方向完全正确。结论本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因的部分序列并成功构建其正义、反义真核表达载体,从而为研究反义抑制人胃癌细胞端粒酶活性对胃癌细胞生物学行为的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 胃肿瘤 病理学 端粒 末端转移酶 遗传 RNA 遗传载体 克隆细胞
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人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达 被引量:9
8
作者 马贵亮 毛伟征 +2 位作者 杨堃 安岗 岱震波 《青岛大学医学院学报》 CAS 2010年第3期189-192,195,共5页
目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂... 目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。 展开更多
关键词 慢病毒感染 遗传载体 肿瘤坏死因子α 基因 脐血 间质干细胞
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融合表达Ag85B-ESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性 被引量:6
9
作者 师长宏 范雄林 +3 位作者 徐志凯 李元 柏银兰 薛莹 《第四军医大学学报》 北大核心 2004年第2期121-124,共4页
目的 :构建融合表达结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)分泌蛋白Ag85B ESAT6真核表达载体 ,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力 .方法 :设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用PCR的方法从... 目的 :构建融合表达结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)分泌蛋白Ag85B ESAT6真核表达载体 ,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力 .方法 :设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与pGEM T easy载体连接后测序 .将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆 ,分别命名为AZ pcD NA3 EF 和EZ pcDNA3 AF,将重组质粒电转CHO细胞 ,RT PCR检测融合蛋白mRNA的表达 ,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达 ;用重组质粒免疫BALB/c小鼠 ,ELISA测定特异性抗体的滴度 .结果 :PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致 .RT PCR可检测融合基因转录出mR NA ,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光 ,AZ pcD NA3 EF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 0 0 0 ,EZ pcD NA3 AF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 5 0 0 .结论 :Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功 。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 Ag$5B ESAT6 融合表达 遗传载体
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腺病毒载体介导bcl-2基因转染对周围神经再生修复的影响 被引量:6
10
作者 杨萍 应大君 +1 位作者 宋林 孙建森 《中华创伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第7期417-421,共5页
目的 探讨腺病毒载体中介bcl- 2基因转染对周围神经再生修复的影响。 方法选用SD大鼠坐骨神经切断损伤模型 ,神经外膜端端对线缝合后 ,于神经缝合处远端 0 .5cm处分别注射Ad s-bcl- 2、Ad as -bcl- 2、Ad lacZ和等渗盐水。术后 4 8h、... 目的 探讨腺病毒载体中介bcl- 2基因转染对周围神经再生修复的影响。 方法选用SD大鼠坐骨神经切断损伤模型 ,神经外膜端端对线缝合后 ,于神经缝合处远端 0 .5cm处分别注射Ad s-bcl- 2、Ad as -bcl- 2、Ad lacZ和等渗盐水。术后 4 8h、7,15和 30d常规 4 0g L多聚甲醛灌注固定 ,取脊髓L4~ 6 节段冰冻切片 ,行x -gal染色、bcl- 2免疫组化和原位杂交染色、GAP - 4 3组化染色 ;并动态观察坐骨神经功能指数 (SFI)以了解后肢恢复情况。 结果 Ad s-bcl - 2组脊髓前角运动神经元中GAP - 4 3表达均较其他组高 (P <0 .0 5 ) ,SFI恢复最好 ;Ad as -bcl- 2组神经元中GAP - 4 3的表达较其他组低 (P <0 .0 5 ) ,SFI恢复最差 ;Ad LacZ组与等渗盐水组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。 结论 腺病毒载体中介bcl- 2基因转染能促进坐骨神经损伤后再生和功能恢复。 展开更多
关键词 腺病毒载体 BCL-2 基因转染 周围神经再生 修复 遗传载体
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真核双表达载体pIRES-hVEGF_(121)cDNA/hBMP-4的构建与鉴定 被引量:6
11
作者 韩雷 汪春兰 +5 位作者 赵宇 何金生 王帮河 王兴宇 杨兵 周志林 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2007年第2期133-136,共4页
目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定... 目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定后,转染COS-7细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。结果真核双表达载体pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4构建成功且hVEGF121cDNA和hBMP-4在COS-7细胞中得到了有效表达。结论hVEGF121和hBMP-4在COS-7细胞中成功表达,为进一步研究打下良好基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子类/遗传 骨形态发生蛋白质类/遗传 遗传载体 基因表达
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腺病毒相关病毒载体的研究进展 被引量:3
12
作者 徐敏 张伟 《国外医学(分子生物学分册)》 CSCD 2002年第5期308-310,共3页
实现基因治疗的关键在于目的基因的高效转移并适度表达 ,这将直接影响其治疗的效率和安全性。因此 ,探寻理想的基因转移载体显得尤为重要。腺病毒相关病毒 (adeno- associated virus,AAV)是一种缺陷型的单链DNA病毒 ,既可以转染分裂细... 实现基因治疗的关键在于目的基因的高效转移并适度表达 ,这将直接影响其治疗的效率和安全性。因此 ,探寻理想的基因转移载体显得尤为重要。腺病毒相关病毒 (adeno- associated virus,AAV)是一种缺陷型的单链DNA病毒 ,既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞。 AAV在宿主体内以定向整合的方式存在。 AAV重组体在细胞内能长期稳定地表达 ,且在体内不引起明显的病理变化 ,表明 AAV作为基因治疗的载体是安全。 展开更多
关键词 腺病毒相关病毒载体 研究进展 遗传载体 基因治疗
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用限制性内切酶制备T载体 被引量:8
13
作者 陆哲明 柯杨 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期726-728,共3页
目的 :介绍一种制备T载体的方法。方法 :用限制性内切酶XcmⅠ酶切 ,在两端产生T末端 ,制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。 结果 :PCR产物直接和T载体连接 ,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化 ,对转化子提... 目的 :介绍一种制备T载体的方法。方法 :用限制性内切酶XcmⅠ酶切 ,在两端产生T末端 ,制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。 结果 :PCR产物直接和T载体连接 ,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化 ,对转化子提取质粒进行酶切鉴定 ,证明阳性率达 80 %。结论 :制备T载体过程简单 ,质量稳定 ,产量高 。 展开更多
关键词 T载体 DNA限制酶类 遗传载体 基因扩增
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逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统的构建和鉴定 被引量:7
14
作者 钟琦 黄志刚 +5 位作者 房居高 陈晓红 张伟 黑虎 王鸿 韩德民 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 北大核心 2007年第9期505-509,共5页
目的构建并鉴定表达MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统并检测其对于喉癌多药耐药细胞系(LSC-1/TAX)多药耐药表型的逆转效果。方法根据MDR-1基因序列,设计3条寡聚核苷酸序列,合成互补DNA链,插入慢病毒表达质粒pLVTHM中,与pCMV-dR8.74和pMD2... 目的构建并鉴定表达MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统并检测其对于喉癌多药耐药细胞系(LSC-1/TAX)多药耐药表型的逆转效果。方法根据MDR-1基因序列,设计3条寡聚核苷酸序列,合成互补DNA链,插入慢病毒表达质粒pLVTHM中,与pCMV-dR8.74和pMD2G共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。以RT-PCR、realtimePCR及Westernblot方法检测三条siRNA在人喉癌耐药细胞系(LSC-1/TAX)中的干扰效率,并采用MTT方法检测干扰前后化疗药物的敏感性。结果通过酶切和测序证实慢病毒载体构建正确,产生能够表达GFP和siRNA的慢病毒颗粒,浓缩滴度为>1×108TU/ml。三条siRNA均可以感染LSC-1/TAX细胞系,其中第三条siRNA敲减效果最佳。结论成功建立逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统,为逆转喉癌多药耐药表型的实验奠定了基础。 展开更多
关键词 抗药性 多药 喉肿瘤 RNA干扰 慢病毒属 遗传载体
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热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定 被引量:8
15
作者 徐小娜 曲彦 《青岛大学医学院学报》 CAS 2008年第2期162-164,167,共4页
目的构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAd-HSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病... 目的构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAd-HSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAdvHSP。收获病毒进行滴度鉴定,RT-PCR方法检测目的基因在Hela细胞的转录表达。结果PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒;荧光显微镜下可观察到GFP的表达,收获病毒的滴度为3.2×1012U/L。结论成功构建pAd-HSP70重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录。 展开更多
关键词 HSP70热休克蛋白质类 腺病毒科 遗传载体
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双酶切和无缝克隆方法构建HCV CORE表达载体的比较 被引量:8
16
作者 王敏敏 赵婕 +4 位作者 常亚磊 陈浩男 陈思思 宋静 魏建宏 《山西医药杂志》 CAS 2017年第3期267-270,共4页
目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-... 目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因聚合酶链反应(PCR)片段,形成带有相同黏性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法利用同源重组的原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经XhoⅠ酶切的PLVX-IRES-ZsGreen1线性载体重组连接,连接产物同样转化入感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果跟双酶切载体构建方法比较,同源重组法步骤相对简单,可以更高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。结论同源重组法可更高效地构建载体,但假阳性率高。 展开更多
关键词 遗传载体 克隆 分子 同源重组
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鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体内外的表达 被引量:3
17
作者 陈玮 邵传森 +6 位作者 沈建根 鲍建芳 潘建平 韩伟 寿林 项哨 郑树 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2002年第1期15-18,共4页
目的 :构建双亚基共表达鼠白细胞介素 - 12 (m IL- 12 )真核表达质粒 ,并观察其在体内外的表达。方法 :将m IL - 12 p35和 p4 0全长编码 c DNA构建在 pc DN A 3.1载体上 ,然后把 p35表达单元 (CMV- p35 - BGH PA)插入pc DNA 3.1/ p4 0载... 目的 :构建双亚基共表达鼠白细胞介素 - 12 (m IL- 12 )真核表达质粒 ,并观察其在体内外的表达。方法 :将m IL - 12 p35和 p4 0全长编码 c DNA构建在 pc DN A 3.1载体上 ,然后把 p35表达单元 (CMV- p35 - BGH PA)插入pc DNA 3.1/ p4 0载体 ,使两个目的基因均受各自的启动子 CMV控制 ,构建成 m IL - 12双亚基共表达质粒 p Cm IL -12 ,并进行体内外表达。结果 :p Cm IL - 12在体外转染 COS- 7细胞后 ,经 EL ISA证实有 m IL- 12表达 ,其表达上清能在体外明显增强小鼠 NK细胞活性。小鼠皮内注射 p Cm IL - 12亦能增强小鼠 NK细胞活性。结论 :所构建的质粒在体内外均能表达有生物学活性的 m IL- 展开更多
关键词 白细胞介素-12 生物合成 质粒 基因表达 MIL-12 天然杀伤细胞 遗传载体 分子克隆 双亚基共表达 小鼠
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肌腱愈合及粘连形成机制的研究:胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达 被引量:4
18
作者 程昌志 张正治 +5 位作者 潘险峰 苟俊 孙玮 潘峰 傅晓岚 白贵友 《中国临床康复》 CSCD 2004年第20期3984-3986,i002,共4页
目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检... 目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达,ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1;RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA;ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2.873,P<0.05)。结论:重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。 展开更多
关键词 胰岛素样生长因子Ⅰ 腱/细胞学 基因表达 遗传载体 转染
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SOX9基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达 被引量:7
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作者 许运 陈亮 +4 位作者 朱雪松 施勤 刘勇 顾勇 唐天驷 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第47期3376-3380,共5页
目的 构建SOX9基因的慢病毒载体并使其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中表达.方法 通过RT-PCR获得人SOX9基因编码区(CDS)片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产生Pwpxl-MOD2/SOX9,将Pwpxl-MOD2/SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转... 目的 构建SOX9基因的慢病毒载体并使其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中表达.方法 通过RT-PCR获得人SOX9基因编码区(CDS)片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产生Pwpxl-MOD2/SOX9,将Pwpxl-MOD2/SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染293T细胞,获得携带目的基因SOX9基因的重组病毒.同时共转染Pwpxl-MOD2,pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G进另一组293T细胞包装产生空载体慢病毒作为阴性对照.包装好的慢病毒体外感染MSCs,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫印迹检测SOX9的表达;四甲基噻唑蓝(MTT)法测定慢病毒对细胞增殖能力的影响.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实慢病毒载体质粒Pwpxl-MOD中插入片段为基因SOX9.病毒感染MSCs后,经RT-PCR法和免疫印迹证实SOX9基因在MSCs中表达.MTT法检测示慢病毒感染对骨髓间克质干细胞的生长未产生显著影响.结论 成功构建SOX9基因的慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞后能够稳定表达SOX9.为研究椎间盘退变的基因及生物学治疗提供了实验依据. 展开更多
关键词 椎间盘 遗传载体 干细胞 SOX9基因
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mIL-4昆虫表达载体pIZT/V5-His的构建及其高效表达 被引量:3
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作者 孙延波 李菁华 史红艳 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期194-195,198,共3页
目的:构建昆虫表达载体pIZT/V5-His的基础上,建立能稳定高效表达mIL-4的昆虫细胞系。方法:PCR体外扩增mIL-4,将目的基因mIL-4和昆虫表达载体pIZT/V5-His用EcoRI和XbaI做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含mIL-4目的基因的表达载体pIZT/V5-... 目的:构建昆虫表达载体pIZT/V5-His的基础上,建立能稳定高效表达mIL-4的昆虫细胞系。方法:PCR体外扩增mIL-4,将目的基因mIL-4和昆虫表达载体pIZT/V5-His用EcoRI和XbaI做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含mIL-4目的基因的表达载体pIZT/V5-His-IL4。采用脂质体法将重组DNA转染到生长良好的昆虫细胞Sf9中。转染后的第3天,用ELISA方法检测转染细胞的培养上清中分泌型蛋白mIL-4的含量。结果:转染后的昆虫细胞Sf9能产生大量的mIL-4,含量可达1 mg.L-1,明显高于对照组(0.003 mg.L-1)。结论:昆虫表达载体pIZT/V5-His可用于mIL-4的高效表达。 展开更多
关键词 白细胞介素4 昆虫细胞SF9 基因表达 遗传载体
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