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可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备 被引量：11
1
作者 杨兵 何金生 +7 位作者 石长信 张梅 虞结梅 谢灿 陆燕燕 付远辉 彭向雷 洪涛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期682-685,共4页
构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV... 构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。 展开更多
关键词 辅助病毒依赖型腺病毒载体 人呼吸道合胞病毒融合蛋白 逆转录聚合酶链式反应 免疫印迹
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辅助病毒依赖型腺病毒载体研究进展 被引量：5
2
作者 付远辉 何金生 +1 位作者 石长信 洪涛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期147-152,共6页
辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd)缺乏所有腺病毒的编码序列,与非复制型的第一代腺病毒载体(first-generation adenoviral vector,FGAd)相比,具有载体免疫原性低、安全、转移容量大和持续表达等特点... 辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd)缺乏所有腺病毒的编码序列,与非复制型的第一代腺病毒载体(first-generation adenoviral vector,FGAd)相比,具有载体免疫原性低、安全、转移容量大和持续表达等特点,现广泛用于遗传性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等的基因治疗和特异性靶向治疗研究。本文综述了HDAd构建和应用等方面的研究进展及未来的发展方向。 展开更多
关键词 辅助病毒依赖型腺病毒载体 基因治疗
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辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率 被引量：1
3
作者 郑娴娴 何金生 +6 位作者 付远辉 徐少华 谢灿 石长信 张梅 王小波 洪涛 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1108-1115,共8页
构建可表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定。荧光显微镜证实HDAd/EGFP可表达,电镜下观察到经... 构建可表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定。荧光显微镜证实HDAd/EGFP可表达,电镜下观察到经CsCl纯化后的腺病毒的典型形态。分光光度计法测定病毒的浓度为4.0×1012颗粒数(Virus particle,vp)/mL。与可表达EGFP的第一代腺病毒载体(First generation adenoviral vector,FGAd)FGAd/EGFP进行了体外感染和转基因表达效率的比较研究,分别用约2000vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞,流式细胞仪检测EGFP的表达情况。通过相同时间点流式细胞仪分析EGFP的表达情况,可见HDAd/EGFP感染早期的A549细胞较FGAd/EGFP有更高的荧光表达率及更高的表达强度,显示HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性,是一种更有价值的疫苗载体。 展开更多
关键词 辅助病毒依赖型腺病毒载体 第一代腺病毒载体 增强型绿色荧光蛋白 转基因表达
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可表达新型甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建
4
作者 张梅 江彦泽 +4 位作者 陈念华 付远辉 乔伟 王荷 何金生 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第1期157-160,共4页
根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株基因序列(A/California/07/2009(H1N1)),全基因合成甲型流感病毒血凝素(HA)编码基因,利用辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd)骨架质粒pSC15B,构建可表达HA基因的HDAd/HA DNA分子载体,以磷酸钙法转染... 根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株基因序列(A/California/07/2009(H1N1)),全基因合成甲型流感病毒血凝素(HA)编码基因,利用辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd)骨架质粒pSC15B,构建可表达HA基因的HDAd/HA DNA分子载体,以磷酸钙法转染293Cre4细胞,与辅助病毒H14连续共感染,获得HDAd/HA载体,并大量制备和纯化,进行形态观察和体外感染的初步鉴定。透射电镜下观察HDAd/HA载体具有典型腺病毒形态;与辅助病毒H14共感染293细胞,RT-PCR检测HA基因有转录,显示成功构建HDAd/HA重组腺病毒载体,为甲型流感病毒体内免疫效果和免疫保护作用的研究奠定实验基础。 展开更多
关键词 辅助病毒依赖型腺病毒载体 甲型H1N1流感病毒 血凝素
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