外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(Exo Quick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、R...外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(Exo Quick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、RIPA裂解液、SDS裂解液提取外泌体蛋白质的效果。Brodford法和BCA定量测定结果表明,EQ方法分离0.5 m L唾液外泌体得到的蛋白质含量高于UC方法分离2 m L唾液所得到的蛋白质。进一步的质谱分析表明,前者鉴定到的蛋白质数目亦多于后者;试剂盒分离唾液外泌体与尿素缓冲液提取外泌体蛋白质的方法联用效果最佳,鉴定到194种蛋白质。本方法重现性好、样品用量少、检测结果稳定,可为在唾液外泌体中筛选疾病的标志物提供方法学参考。展开更多
文摘外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(Exo Quick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、RIPA裂解液、SDS裂解液提取外泌体蛋白质的效果。Brodford法和BCA定量测定结果表明,EQ方法分离0.5 m L唾液外泌体得到的蛋白质含量高于UC方法分离2 m L唾液所得到的蛋白质。进一步的质谱分析表明,前者鉴定到的蛋白质数目亦多于后者;试剂盒分离唾液外泌体与尿素缓冲液提取外泌体蛋白质的方法联用效果最佳,鉴定到194种蛋白质。本方法重现性好、样品用量少、检测结果稳定,可为在唾液外泌体中筛选疾病的标志物提供方法学参考。
文摘目的 比较超高速差速离心法和试剂盒法提取肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)源性外泌体的纯度,并评价超高速差速离心法提取外泌体的稳定性和适用性。探究低氧肺动脉高压(PH)大鼠血浆源性外泌体对PASMCs表型转化和肺动脉内皮细胞(PAECs)内皮间质转化的作用。方法 ① 收集PASMCs培养基上清液,分别用超高速差速离心法和试剂盒法提取外泌体,通过透射电子显微镜观察外泌体形态、纳米微粒示踪分析检测外泌体粒径分布、蛋白质免疫印迹法检测外泌体标志蛋白表达,评估外泌体纯度;② 收集PAECs培养基上清液和大鼠血浆,超高速差速离心法分别提取外泌体并评估外泌体纯度;③ 构建低氧PH大鼠模型,超高速差速离心法分别提取常氧和低氧大鼠血浆源性外泌体并作用于PASMCs和PAECs,免疫荧光检测各标志蛋白表达以评估外泌体对PASMCs表型转化和PAECs内皮间质转化的影响。结果 ① 超高速差速离心法提取的PASMCs、PAECs和血浆源性外泌体形态典型,纯度较高;而试剂盒法提取的PASMCs源性外泌体纯度较低。② 低氧PH大鼠血浆源性外泌体诱导PASMCs发生表型转化和PAECs发生内皮间质转化。结论 超高速差速离心法提取外泌体纯度优于试剂盒法,实验方法稳定且适用性强。低氧PH大鼠血浆源性外泌体可诱导PH肺血管重构。
