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苦豆子赖氨酸脱羧酶基因克隆与表达分析 被引量：6
1
作者 杨毅 陆姗姗 +1 位作者 刘萍 田蕾 《草业学报》 CSCD 北大核心 2016年第8期128-135,共8页
赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)生物合成的第一个关键酶基因。根据近缘物种苦参的赖氨酸脱羧酶基因设计特异引物,同源克隆法克隆了苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的蛋白质编码区序列,全长136... 赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)生物合成的第一个关键酶基因。根据近缘物种苦参的赖氨酸脱羧酶基因设计特异引物,同源克隆法克隆了苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的蛋白质编码区序列,全长1368bp,命名为Sa-LDC,GenBank登录号为KM249871。生物信息学分析表明SaLDC编码区序列无内含子,与苦参和狗苦参的LDC序列一致性均达到97%;属于Ⅲ型5-磷酸吡哆醛依赖酶[typeⅢpyridoxal 5-phosphate(PLP)-dependent enzymes,PLPDE-Ⅲ]超基因家族,功能活跃。Sa-LDC编码455个氨基酸残基,其编码的肽链相对分子质量49.14kD,理论等电点5.63,无信号肽和跨膜结构;在其氨基酸序列中具有产喹诺里西啶生物碱的特征性保守位点Phe^(340);系统进化树将苦豆子与其他产喹诺里西啶类生物碱的植物聚为一类。qPCR和HPLC检测显示,苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的表达和氧化苦参碱的积累均受干旱胁迫的影响,且基因的表达量与氧化苦参碱的积累呈正相关关系。 展开更多
关键词 苦豆子 赖氨酸脱羧酶基因 基因克隆 基因表达 氧化苦参碱
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苦豆子内生真菌诱导子促进宿主生物碱合成关键酶基因表达的荧光定量PCR检测 被引量：4
2
作者 孙牧笛 张庆宸 +4 位作者 胡丽杰 李文学 闫思远 吕苗苗 顾沛雯 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2018年第19期4621-4627,共7页
目的建立荧光定量PCR(qRT-PCR)检测苦豆子内生真菌诱导子促进宿主生物碱合成关键酶—赖氨酸脱羧酶(LDC)基因的表达的方法。方法根据苦豆子LDC和Lectin基因序列设计目的基因引物QLDC-F/QLDC-R和内参基因引物Lectin-F/Lectin-R;以5倍梯度... 目的建立荧光定量PCR(qRT-PCR)检测苦豆子内生真菌诱导子促进宿主生物碱合成关键酶—赖氨酸脱羧酶(LDC)基因的表达的方法。方法根据苦豆子LDC和Lectin基因序列设计目的基因引物QLDC-F/QLDC-R和内参基因引物Lectin-F/Lectin-R;以5倍梯度稀释的c DNA作为标准样品,建立目的基因QLDC-F/QLDC-R和内参基因Lectin-F/Lectin-R的标准曲线,优化qRT-PCR反应体系与反应条件,分析比较半定量PCR与qRT-PCR的灵敏度;在苦豆子内生真菌NDZKDF13诱导子不同诱导时间下,高效液相色谱(HPLC)测定宿主氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)的含量,qRT-PCR检测LDC基因的表达量,分析在内生真菌诱导下LDC基因与OMA合成积累的关系。结果在qRT-PCR体系中c DNA质量浓度为200 ng/μL,退火温度为61℃时检测结果最好;构建的目的基因和内参基因标准曲线,其循环阈值与模板浓度均呈良好的线性关系,扩增效率都在99%以上,灵敏度是半定量PCR的25倍;在内生真菌NDZKDF13诱导子诱导作用下,宿主LDC基因的表达量在第6天达到峰值,为对照的25.58倍;OMA含量的增加滞后于LDC基因表达量的变化,在诱导子处理第9天达到最高峰。结论成功将qRT-PCR技术应用于苦豆子的功能基因研究。通过对各种条件的优化探索,建立了准确和简单易行的检测苦豆子的功能基因表达的平台。 展开更多
关键词 荧光定量PCR 苦豆子 内生真菌诱导子 赖氨酸脱羧酶基因 氧化苦参碱
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苦豆子赖氨酸脱羧酶基因表达与苦参碱和氧化苦参碱含量的关系 被引量：6
3
作者 杨毅 田蕾 +1 位作者 刘萍 刘姣蓉 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期846-849,共4页
目的研究干旱胁迫下苦豆子子叶中赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)基因表达量与苦参碱(matrine,MA)和氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)含量的关系。方法以不同质量分数PEG 6000胁迫萌动苦豆子种子,72 h后高效液相色谱(HPLC)测定其苦... 目的研究干旱胁迫下苦豆子子叶中赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)基因表达量与苦参碱(matrine,MA)和氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)含量的关系。方法以不同质量分数PEG 6000胁迫萌动苦豆子种子,72 h后高效液相色谱(HPLC)测定其苦参碱和氧化苦参碱含量,荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,q PCR)测定赖氨酸脱羧酶表达量。结果萌动苦豆子种子在轻度胁迫(PEG质量分数<15%)下,子叶中苦参碱和氧化苦参碱含量降低,重度胁迫(PEG质量分数>20%)下,子叶中苦参碱和氧化苦参碱含量升高。荧光定量PCR显示,子叶中赖氨酸脱羧酶表达量随胁迫加剧呈先降后升的趋势,特别是在轻度和重度胁迫下,赖氨酸脱羧酶表达量与苦参碱和氧化苦参碱含量变化一致。结论苦豆子子叶中苦参碱和氧化苦参碱含量与赖氨酸脱羧酶的表达有一定的关系。 展开更多
关键词 苦豆子 氧化苦参碱 赖氨酸脱羧酶基因(LDC) 荧光定量PCR 基因表达
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湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲分布及与LDC表达的关系 被引量：6
4
作者 杜次 李菁 +2 位作者 田向荣 朱越 彭清忠 《中药材》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期361-364,共4页
目的:测定湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲含量,分析石杉碱甲分布与赖氨酸脱羧酶基因(LDC)表达的关系。方法:采用HPLC测定蛇足石杉根、茎、叶中石杉碱甲含量,HPLC条件:Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-0.08 mo... 目的:测定湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲含量,分析石杉碱甲分布与赖氨酸脱羧酶基因(LDC)表达的关系。方法:采用HPLC测定蛇足石杉根、茎、叶中石杉碱甲含量,HPLC条件:Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-0.08 mol/L醋酸铵(32∶68,V/V),流速为1.0 mL/min,柱温为25℃,检测波长为308nm。以肌动蛋白基因为内参物,通过半定量RT-PCR比较LDC在根、茎、叶中的表达量。结果:石杉碱甲在0.5～10.0μg/mL线性关系良好,平均加样回收率为102%,RSD为0.32%;湘西蛇足石杉根、茎、叶中石杉碱甲含量分别为(118.35±0.77)μg/g、(411.09±2.47)μg/g、(562.15±2.86)μg/g;半定量RT-PCR分析表明LDC在根、茎、叶中表达量无明显差异。结论:湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲含量差异显著;推测赖氨酸脱羧酶不是石杉碱甲生物合成中的关键酶。 展开更多
关键词 蛇足石杉 石杉碱甲 赖氨酸脱羧酶基因(LDC) 高效液相色谱法 半定量RT-PCR
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苦豆子SaLDC密码子偏好性分析、优化及原核表达 被引量：5
5
作者 洪园淑 周玉梅 +1 位作者 李文娟 刘萍 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期429-435,共7页
目的研究苦豆子SaLDC密码子偏好性、优化及原核表达。方法运用EMBOSS在线程序中的CHIPS、CUSP和CodonW软件分析SaLDC密码子的偏好性,根据大肠杆菌密码子的偏好性对SaLDC密码子进行优化,并将优化后的基因命名为optSaLDC;构建重组表达载体... 目的研究苦豆子SaLDC密码子偏好性、优化及原核表达。方法运用EMBOSS在线程序中的CHIPS、CUSP和CodonW软件分析SaLDC密码子的偏好性,根据大肠杆菌密码子的偏好性对SaLDC密码子进行优化,并将优化后的基因命名为optSaLDC;构建重组表达载体pET⁃28a(+)⁃optSaLDC,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导SaLDC蛋白表达,并对表达蛋白进行质谱分析。结果SaLDC有28个密码子的RSCU值>1.00,偏好使用以A/T结尾的密码子;SaLDC的密码子使用偏好性与拟南芥最接近,与大肠杆菌差别最大。优化后的optSaLDC在大肠杆菌中最佳表达条件为IPTG浓度1.0 mmol/L,诱导温度15℃,诱导时间16 h。LC⁃MS/MS鉴定诱导得到的SaLDC蛋白分子质量为48990.51 Da。结论诱导获得的optSaLDC纯化蛋白可用于后续体外SaLDC酶活性分析,为深入研究该基因的功能提供依据。 展开更多
关键词 苦豆子 赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC) 密码子偏好性 密码子优化 原核表达
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基于盐胁迫的苦豆子种子生理特性和赖氨酸脱羧酶基因表达分析 被引量：4
6
作者 周玉梅 洪园淑 +2 位作者 李文娟 刘萍 田蕾 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第12期2755-2759,共5页
【目的】本文研究了盐胁迫下苦豆子萌发种子的生理特性和赖氨酸脱羧酶基因SaLDC表达量的变化。【方法】用NaCl溶液胁迫苦豆子种子,统计盐胁迫后种子的各项活力指标,测定子叶的PMP、MDA和Pro含量以及SOD、POD、CAT抗氧化酶活性。qPCR测定... 【目的】本文研究了盐胁迫下苦豆子萌发种子的生理特性和赖氨酸脱羧酶基因SaLDC表达量的变化。【方法】用NaCl溶液胁迫苦豆子种子,统计盐胁迫后种子的各项活力指标,测定子叶的PMP、MDA和Pro含量以及SOD、POD、CAT抗氧化酶活性。qPCR测定SaLDC表达量,HPLC测定Cad含量。【结果】随着NaCl溶液浓度的增加,种子的各项活力指标降低,相对盐害率上升。苦豆子能耐受NaCl溶液胁迫,保持种子正常萌发率达到50%的阈值为200 mmol·L-1。轻度盐胁迫(NaCl溶液≤100 mmol·L-1)时,POD酶起主要保护作用,在重度盐胁迫(NaCl溶液>200 mmol·L-1)下,CAT酶起主要保护作用;SaLDC在子叶中表达量最高,下胚轴中表达量最低,盐胁迫促使该基因表达上调;子叶中未检测到Cad,但在下胚轴和胚根中随NaCl溶液浓度的增加Cad含量降低。【结论】盐胁迫影响苦豆子种子的萌发和相关耐盐生理特性,SaLDC对盐胁迫的应答存在组织特异性。 展开更多
关键词 苦豆子 盐胁迫 赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC) 尸胺 耐盐生理
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