细胞培育肉种子细胞永生化诱导研究 被引量：1

1

作者 杨峰 李莹莹 +2 位作者 王守伟 刘文婷 李石磊 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第12期52-62,共11页

目的:构建永生化种子细胞是解决细胞培育肉种子细胞来源高效、可持续的有效手段。方法:基于猪成肌细胞,通过端粒酶逆转录酶进行诱导载体的构建,核转染到细胞后分别通过免疫荧光标记、定量PCR、染色体核型分析等方法进行细胞诱导验证。结... 目的:构建永生化种子细胞是解决细胞培育肉种子细胞来源高效、可持续的有效手段。方法:基于猪成肌细胞,通过端粒酶逆转录酶进行诱导载体的构建,核转染到细胞后分别通过免疫荧光标记、定量PCR、染色体核型分析等方法进行细胞诱导验证。结果:构建永生化细胞诱导载体序列完整度高、无突变;成功将载体转入细胞高效表达并获得诱导阳性细胞株1个;转染后染色体核型未发生不可控的突变;同时诱导后的细胞端粒酶逆转录酶表达量显著高于对照组;更重要的是诱导阳性细胞传代次数突破“Hayflick”增殖界限,实现了200以上的传代次数。结论:构建了猪成肌细胞永生化诱导载体,鉴定了细胞诱导后的稳定性,该永生化种子细胞将在细胞培育肉生产中具有广泛的应用前景。 展开更多

关键词 细胞培育肉 种子细胞 永生化 诱导载体 端粒酶逆转录酶

下载PDF 职称材料

基因治疗靶向载体研究进展(二) 被引量：3

2

作者 贺平 汤钊猷 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2000年第1期67-69,共3页

针对基因治疗安全性，国内外研究的重点之一是寻找理想的靶向表达载体。除了构建靶向转导载体和靶向转录载体外，还有利用可诱导的启动子或人工合成的转录因子，构建靶向诱导系统，以诱导目的基因按一定的时相表达。本文综述有关基因治... 针对基因治疗安全性，国内外研究的重点之一是寻找理想的靶向表达载体。除了构建靶向转导载体和靶向转录载体外，还有利用可诱导的启动子或人工合成的转录因子，构建靶向诱导系统，以诱导目的基因按一定的时相表达。本文综述有关基因治疗靶向诱导载体的研究进展。 展开更多

关键词 基因治疗 靶向诱导载体 启动子 转录因子

下载PDF 职称材料

大鼠Fcγ RⅡb基因慢病毒的制备及其在BMDC细胞中的表达检测

3

作者 张武 丁洋 +1 位作者 李立强 李明皓 《宁夏医科大学学报》 2019年第2期138-142,151,共6页

目的构建大鼠FcγRⅡb慢病毒诱导表达载体,表达病毒与调节病毒共同感染大鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)并检测FcγRⅡb的表达。方法提取大鼠肝脏mRNA,并以其为模板通过逆转录及PCR获得FcγRⅡb基因片段,利用酶切重连技术构建慢病毒表达载... 目的构建大鼠FcγRⅡb慢病毒诱导表达载体,表达病毒与调节病毒共同感染大鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)并检测FcγRⅡb的表达。方法提取大鼠肝脏mRNA,并以其为模板通过逆转录及PCR获得FcγRⅡb基因片段,利用酶切重连技术构建慢病毒表达载体TRE与FcγRⅡb重组慢病毒载体。使用HEK293T细胞分别包装TRE-FcγRⅡb表达病毒与TET-on调节病毒,并检测其病毒滴度;离体诱导培养大鼠骨髓来源未成熟树突状细胞并鉴定。采用OX-62免疫磁珠分选大鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(i DC),用表达病毒和可诱导病毒共感染i DC。经一定梯度的强力霉素(DOX)诱导,分别用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印记法(WB)检测BMDC中FcγRⅡb mRNA水平及FcγRⅡb蛋白表达水平;免疫荧光检测树突状细胞中FcγRⅡb的表达;电镜对分离培养的BMDC进行形态学观察和鉴定。结果成功构建TRE-FcγRⅡb重组慢病毒载体,经酶切、PCR电泳条带鉴定成功,基因序列测定结果与GenBank比对同源性100%。体外诱导培养BMDC,5d左右观察到明显的树突样凸起。成功用慢病毒感染BMDC后,FcγRⅡb mRNA和FcγRⅡb蛋白水平均较未感染BMDC有明显的增高。结论成功制备了含大鼠FcγRⅡb基因慢病毒,用其感染未成熟树突状细胞并经DOX诱导可实现FcγRⅡb的高表达。 展开更多

关键词 FCΓRIIB 慢病毒表达载体和可诱导载体 诱导表达

下载PDF 职称材料

北非蝎昆虫毒素AaHIT1基因的原核表达和转基因分析 被引量：9

4

作者 苏力坦·阿巴白克力 姬生健 朱玉贤 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期182-185,共4页

将北非蝎昆虫毒素 (AndroctonusaustralisHectorinsecttoxin ,AaHIT1)基因克隆入温度诱导表达载体pBV2 2 0 ,并在宿主菌E .coliDH5α中进行诱导表达 .表达定位分析发现 ,AaHIT1大部分存在于包涵体中 .蛋白质N 端测序证实了体外表达的AaH... 将北非蝎昆虫毒素 (AndroctonusaustralisHectorinsecttoxin ,AaHIT1)基因克隆入温度诱导表达载体pBV2 2 0 ,并在宿主菌E .coliDH5α中进行诱导表达 .表达定位分析发现 ,AaHIT1大部分存在于包涵体中 .蛋白质N 端测序证实了体外表达的AaHIT1蛋白的正确性 .将AaHIT1基因转化入烟草中并获得了转基因植株 ,基因组PCR、RT PCR及Northern印迹分别证实AaHIT1基因已正确地插入到烟草基因组中并已得到表达 .抗虫实验表明 ,该转基因烟草对白粉虱有明显的抗性 . 展开更多

关键词 北非蝎昆虫毒素 基因表达 原核表达 温度诱导表达载体 包涵体 AaHIT1 抗虫基因 转基因作物

下载PDF 职称材料

水稻Rubisco小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建 被引量：8

5

作者 胥华伟 史国安 +1 位作者 范丙友 侯典云 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期455-459,共5页

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻(Oryza sativa)中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基... 高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻(Oryza sativa)中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。 展开更多

关键词 水稻 RUBISCO小亚基 启动子 光诱导表达载体

下载PDF 职称材料

乳酸乳球菌高效电转化方法的建立 被引量：8

6

作者 任大勇 李昌 +5 位作者 秦艳青 杜寿文 郭欢欢 刘宏锋 洛阳 金宁一 《中国兽药杂志》 2012年第1期5-9,共5页

以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactis NZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影... 以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactis NZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明:在固定电阻200Ω、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2 mm规格的电击杯,加入浓度为1.2μg/μL的质粒,在电场强度和脉冲时间分别为10 kV/cm和5 ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2 h后涂板计数,转化效率最高可以达到2.6×104 CFU/μg DNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。 展开更多

关键词 乳酸乳球菌 电转化 转化效率 感受态细胞 诱导型表达载体

下载PDF 职称材料

乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定 被引量：6

7

作者 郝凤奇 李景梅 杨桂连 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期624-628,共5页

为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA... 为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA基因替换原组成型启动子P32,构建乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N。为检测载体的诱导表达功能,以gfp基因作为报告基因,构建重组表达载体pW425N-gfp,以分离自仔猪肠道内嗜酸乳杆菌为受体菌,电转化法制备重组乳酸菌pW425N-gfp/L.acidophilus。结果表明,重组载体能够在Nisin诱导下表达目的荧光蛋白,并且最佳Nisin有效浓度为30 ng/mL,最佳诱导时间为3 h。该表达载体的构建为外源功能性蛋白在乳酸菌中的诱导表达奠定基础。 展开更多

关键词 乳酸菌 诱导表达载体 NISIN

下载PDF 职称材料

可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达 被引量：5

8

作者 周明 石新艳 +7 位作者 田少奇 王丽 张积华 孙康 邢士超 孙伟雪 黄洪杰 吴丹 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期482-487,共6页

目的构建可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体,并研究hBMP-2在人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,HUMSCs)中的可诱导性表达。方法以pcDNA-hBMP-2为模板,通过PCR反应获取hBMP-2,运用GATEWAY技术构建pLV/EX... 目的构建可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体,并研究hBMP-2在人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,HUMSCs)中的可诱导性表达。方法以pcDNA-hBMP-2为模板,通过PCR反应获取hBMP-2,运用GATEWAY技术构建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-反向反式激活因子(reverse transactivator,rtTA),通过PCR鉴定重组慢病毒载体构建。将重组慢病毒与辅助质粒共同转染293FT细胞,包装成能表达hBMP-2的可控性慢病毒,并测定病毒滴度。用病毒转染HUMSCs,使用强力霉素进行诱导,分别在相同诱导时间(48h)不同诱导浓度(0、10、100ng/mL,1、10、100μg/mL)及不同诱导时间(12、24、48、72h)相同诱导浓度(10μg/mL)两种情况下用ELISA法测定hBMP-2的表达情况。对转染前后的HUMSCs进行成骨诱导,用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况。结果成功构建了携带hBMP-2的可控性慢病毒载体pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA,并获得相应的病毒,病毒滴度分别为3.5×108TU/mL和9.5×107TU/mL;病毒转染HUMSCs后,HUMSCs可通过强力霉素的诱导可控性表达hBMP-2。在相同诱导时间情况下,强力霉素10μg/mL时诱导表达最强;而在相同诱导浓度下,hBMP-2的表达在诱导48h达峰值。HUMSCs成骨诱导培养2周后,茜素红染色示胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。结论通过GATEWAY技术可以建立携带hBMP-2目的基因的可控性慢病毒载体,为进一步研究hBMP-2诱导HUMSCs成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础,并提供了一种新的实验思路。 展开更多

关键词 可诱导慢病毒载体 HBMP-2 Tet-on系统 人脐血间充质干细胞 强力霉素

原文传递

AtDME1化学诱导表达载体的构建及其瞬时表达 被引量：4

9

作者 常英英 高亚南 +3 位作者 梁立雄 丁昌俊 苏晓华 张冰玉 《东北林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期75-79,共5页

以拟南芥去甲基化转移酶基因DME1为目的基因,采用酶切、连接和重组反应的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-DME1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结... 以拟南芥去甲基化转移酶基因DME1为目的基因,采用酶切、连接和重组反应的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-DME1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结果表明,较低浓度的17-β-雌二醇处理能够有效调控p ER8-DME1中目的基因的表达,诱导处理后目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高,之后缓慢下降。该载体的成功构建为深入研究DNA去甲基化与植物的生殖发育调控奠定了基础。 展开更多

关键词 pER8-DME1 17-Β-雌二醇 化学诱导表达载体 瞬时表达

下载PDF 职称材料

一株受二噁英类化合物诱导表达绿色荧光蛋白的胃癌细胞系的建立 被引量：2

10

作者 汪畅 王英 +3 位作者 雷垚 张捷 郑明辉 梁勇 《生态毒理学报》 CAS CSCD 2008年第3期244-249,共6页

将人工合成的5个相连的XRE(Xeobiotic response element)和minimal CMV(Human cytomegalovirus)启动子,插入载体pEGFP-1,构建得到载体pXRE5-EGFP.以pXRE5-EGFP转染人胃癌细胞SGC-7901,经过筛选得到一株受2,3,7,8-四氯代二苯并二英(2,3,7... 将人工合成的5个相连的XRE(Xeobiotic response element)和minimal CMV(Human cytomegalovirus)启动子,插入载体pEGFP-1,构建得到载体pXRE5-EGFP.以pXRE5-EGFP转染人胃癌细胞SGC-7901,经过筛选得到一株受2,3,7,8-四氯代二苯并二英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导表达绿色荧光蛋白的细胞系XRE5-SGC-7901.将XRE5-SGC-7901细胞株暴露于不同浓度TCDD(0、250、500pg·mL-1)中,发现TCDD暴露组XRE5-SGC-7901细胞中绿色荧光蛋白的表达量显著升高,且与TCDD暴露浓度呈正相关.新构建的细胞株具有二英类化合物诱导表达绿色荧光蛋白的功能. 展开更多

关键词 二噁英类化合物 诱导表达载体 绿色荧光蛋白

下载PDF 职称材料

上调巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能 被引量：3

11

作者 郑修军 王琦 +1 位作者 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1022-1026,共5页

目的构建大鼠FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,观察其对巨噬细胞的作用。方法以大鼠肝脏mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒四环素(Tet)顺式应答元件(TRE),构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表... 目的构建大鼠FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,观察其对巨噬细胞的作用。方法以大鼠肝脏mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒四环素(Tet)顺式应答元件(TRE),构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒调节质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和调节病毒,测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和调节病毒共感染巨噬细胞,经梯度浓度强力霉素(DOX)诱导,免疫荧光技术检测巨噬细胞FcγRⅡB表达,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。经不同浓度DOX诱导后的腹腔巨噬细胞分别检测吞噬和趋化功能。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。表达和调节病毒滴度均达到106转导单位/m L。巨噬细胞被病毒感染后经DOX诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示,FcγRⅡB能够在巨噬细胞表达;实时荧光定量PCR和Western blot结果显示FcγRⅡB表达水平与DOX浓度呈正相关。巨噬细胞的吞噬和趋化功能与FcγRⅡB表达呈负相关。结论调节巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能。 展开更多

关键词 FcγRⅡB 慢病毒诱导表达载体 抑制性受体 巨噬细胞 吞噬和趋化

下载PDF 职称材料

构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体及其在肝癌细胞系Huh-7中的表达 被引量：2

12

作者 顾博 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期76-79,99,共5页

目的构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,为进一步研究MST1与肝癌之间的关系提供理想的模型。方法克隆MST1基因到慢病毒载体pLVPT-tTRKRAB中,2种慢病毒载体(pLVPT-tTRKRAB-MST1和pLV-tTRKRAB-Red)与包装质粒通过293FT细胞系介导,分别... 目的构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,为进一步研究MST1与肝癌之间的关系提供理想的模型。方法克隆MST1基因到慢病毒载体pLVPT-tTRKRAB中,2种慢病毒载体(pLVPT-tTRKRAB-MST1和pLV-tTRKRAB-Red)与包装质粒通过293FT细胞系介导,分别包装成病毒颗粒,先后2次去感染肝癌细胞系Huh-7。培养7 d后,使用强力霉素(doxcycline)进行诱导,用Western blot检测MST1表达情况。结果构建了可诱导MST1真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染目的肝癌细胞系Huh-7。在强力霉素诱导条件下,肝癌细胞系Huh-7可以表达MST1。结论成功构建出可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,并获得在强力霉素诱导条件下可以表达MST1的肝癌细胞亚系。 展开更多

关键词 可诱导慢病毒载体 MST1基因 强力霉素

下载PDF 职称材料

AtMET1基因克隆及化学诱导表达分析 被引量：2

13

作者 梁立雄 常英英 +4 位作者 高亚南 王颜波 张伟溪 苏晓华 张冰玉 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2016年第6期946-950,共5页

DNA甲基化是植物基因组中普遍存在的一种的重要表观遗传学机制,对植物生长发育及进化起着重要的调节作用[1-2]。植物体DNA甲基化的建立和维持受多个基因的协同调控,其中MET1（DN-MT1-like METHYLTRANSFERASE 1 gene）是在植物中最早分... DNA甲基化是植物基因组中普遍存在的一种的重要表观遗传学机制,对植物生长发育及进化起着重要的调节作用[1-2]。植物体DNA甲基化的建立和维持受多个基因的协同调控,其中MET1（DN-MT1-like METHYLTRANSFERASE 1 gene）是在植物中最早分离出来的甲基化相关基因,编码DNA甲基化转移酶1（MET1,Methytransferase1）,该酶主要负责保持CG位点的甲基化,通过DNA甲基化作用影响植物的基因组结构、发育和进化。 展开更多

关键词 pER8-MET1 17-Β-雌二醇 化学诱导表达载体 瞬时表达

下载PDF 职称材料

黄瓜ERAF17基因的克隆及相关功能载体构建 被引量：2

14

作者 范亚军 李伟 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期15-18,共4页

目的:探讨黄瓜性别相关基因ERAF17在黄瓜性别调控过程中的作用。方法:通过RT-PCR法克隆黄瓜性别相关基因ERAF17,利用分子克隆技术将目的片段连入植物化学诱导表达载体pER8,选择部分ERAF17序列构建含有目的片段发卡结构的沉默载体。构建... 目的:探讨黄瓜性别相关基因ERAF17在黄瓜性别调控过程中的作用。方法:通过RT-PCR法克隆黄瓜性别相关基因ERAF17,利用分子克隆技术将目的片段连入植物化学诱导表达载体pER8,选择部分ERAF17序列构建含有目的片段发卡结构的沉默载体。构建原核表达载体pET-28a-ERAF17在大肠杆菌中诱导表达ERAF17蛋白并进行纯化。结果:成功构建了植物化学诱导表达载体pER8-ERAF17和含有目的片段发卡结构的沉默载体pMBW330-ERAF17-hp,在含有pET-28a-ERAF17原核表达载体的大肠杆菌中加入IPTG诱导3h后ERAF17表达量最高,通过NT-agerose介质成功纯化出ERAF17的编码蛋白。结论:所构建载体可用于ERAF17基因的功能研究。 展开更多

关键词 ERAF17 化学诱导表达载体 发卡结构 原核表达

原文传递

小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在Gateway技术上的可诱导表达载体的构建 被引量：2

15

作者 李明 丁博 +5 位作者 牛有雄 吕芳芳 杨文丽 Silin Zhong 孙守钧 谢晓东 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期17-22,共6页

以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守... 以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守氨基酸序列WRKYGQK突变为WRKYGEK,为TaWRKY46的新等位基因,命名为TaWRKY46-1。采用Gateway克隆技术构建了该基因的可诱导型超量表达载体,并转化农杆菌,为接下来转基因验证TaWRKY46-1的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 小麦 WRKY转录因子 Gateway克隆技术 可诱导表达载体

下载PDF 职称材料

植物细菌诱导型表达载体的构建 被引量：1

16

作者 曾骥 黄真池 +1 位作者 刘媛 黄永莲 《湛江师范学院学报》 2006年第6期71-74,103,共5页

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对... 根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功. 展开更多

关键词 细菌诱导型启动子 hrap pflp 植物细菌诱导型表达载体

下载PDF 职称材料

含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达 被引量：2

17

作者 刘慧宇 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期561-564,568,共5页

目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导... 目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和可诱导病毒,分别测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和可诱导病毒共感染HT-1080细胞,经梯度浓度强力霉素(Dox)诱导,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,免疫荧光染色检测HT-1080细胞FcγRⅡB表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定,测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL,可诱导病毒滴度达105TU/mL,感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞中表达;实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。结论成功制备了FcγRⅡB慢病毒,感染HT-1080细胞后可实现FcγRⅡB的诱导表达。 展开更多

关键词 FcγRⅡB 慢病毒诱导表达载体 调控表达

下载PDF 职称材料

联合双基因表达载体的构建及其拟南芥转化

18

作者 钟胜 段瑞军 +2 位作者 郭建春 胡新文 符少萍 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第1期52-54,共3页

[目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3... [目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3)基因以及基因上游启动子的DNA序列:CP-CBF3,共2 075 bp。CP是CBF3基因的启动子,受低温诱导。用EcoRI和BamHI双酶切CP-CBF3并置于植物表达载体pCAMBIA1300中,构建CBF3基因冷诱导表达载体pCA-CP-CBF3。然后将带有组成型启动子的肌醇半乳糖苷酶基因AtG-loS3合并于pCA-CP-CBF3中,构建双基因植物表达载体pCA-CP-CBF3-35S-AtGloS3。用真空抽滤虑法将这两个表达载体转化到拟南芥中,并用潮霉素筛选出转基因植物苗。[结果]CBF3和AtGloS3基因均来自拟南芥,而CBF3不存在内含子,AtGloS3基因存在内含子,故以CB-1、CB-2为引物的非转基因植物中也能得到带,而以AT-1、AT-2为引物的非转基因植物不能得到带。[结论]该研究中pCA-CP-CBF3是1个对照,实验的后续工作需进一步进行。 展开更多

关键词 CBF3冷诱导表达载体 CBF3和AtGolS3双基因表达载体 拟南芥转化

下载PDF 职称材料

RhoB对胃癌细胞SGC7901的负性调控作用

19

作者 孙立军 毕锋 +5 位作者 潘阳林 刘娜 梁洁 张国云 乔泰东 樊代明 《现代肿瘤医学》 CAS 2005年第1期4-7,共4页

目的　研究RhoB对胃癌细胞SGC7901增殖调控作用。方法　用PCR扩增出RhoB的全长cDNA,构建RhoB可诱导表达载体pGene/V5-His-RhoB;脂质体介导法将调控载体pSwitch及诱导表达载体pGene/V5-His-RhoB先后转入人胃癌细胞SGC7901中,筛选出稳定... 目的　研究RhoB对胃癌细胞SGC7901增殖调控作用。方法　用PCR扩增出RhoB的全长cDNA,构建RhoB可诱导表达载体pGene/V5-His-RhoB;脂质体介导法将调控载体pSwitch及诱导表达载体pGene/V5-His-RhoB先后转入人胃癌细胞SGC7901中,筛选出稳定抗性克隆;Westernblot检测米非斯酮诱导后转染细胞中RhoB蛋白的表达。用MTTassay检测RhoB转染细胞株的生长速度、双苯并咪唑染料(Hoechst33258)活细胞吸收分析法、流式细胞仪(FCM)检测RhoB对胃癌细胞凋亡指数作用。结果　成功构建RhoB可诱导真核表达载体pGene/V5-His-RhoB,并经酶切和测序鉴定;转染后经潮霉素B和Zeocin筛选出稳定抗性克隆SGC7901 /RhoB;米非斯酮诱导出RhoB蛋白表达,在诱导 24小时后蛋白表达最高;细胞增殖试验结果显示,RhoB表达上调后胃癌细胞增殖受到抑制;细胞凋亡检测提示高表达RhoB可明显诱导胃癌细胞凋亡。结论　RhoB对胃癌细胞增殖具有负性调控作用,可诱导胃癌细胞出现凋亡。 展开更多

关键词 RHOB 胃癌 可诱导表达载体

下载PDF 职称材料

低氧诱导VEGF基因表达载体治疗家兔肢体缺血性疾病的实验研究 被引量：1

20

作者 殷爱红 武文琦 +2 位作者 崔世军 滕旭 郑少鹏 《首都医科大学学报》 CAS 2012年第3期356-360,共5页

目的探讨低氧诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达载体对家兔肢体缺血性模型的基因治疗效果。方法通过切除髂外动脉远端和股动脉分支制作家兔左后肢缺血模型,术后立即将含VEGF基因的低氧诱导表... 目的探讨低氧诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达载体对家兔肢体缺血性模型的基因治疗效果。方法通过切除髂外动脉远端和股动脉分支制作家兔左后肢缺血模型,术后立即将含VEGF基因的低氧诱导表达载体6HRE-pcDNA-VEGF165多点注射至患侧肌肉内,并于不同时间点进行后肢胫动脉血压测量和动脉血管造影。结果与对照组相比,应用低氧诱导VEGF基因表达载体的基因治疗组胫动脉血压恢复快;动脉血管造影显示基因治疗组动脉充盈早于对照组,新生血管多于对照组,早于对照组建立侧支循环。结论低氧诱导VEGF基因表达载体可促进家兔肢体缺血模型新生血管的形成,改善缺血肢体的血液循环。 展开更多

关键词 低氧诱导表达载体 血管内皮细胞生长因子 肢体缺血 基因治疗

下载PDF 职称材料