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甘丙肽2型受体在HEK293细胞中的表达及内化过程 被引量：3
1
作者 吕琼 金艳燕 +4 位作者 吴波 路雅静 李晓晓 赵春礼 徐志卿 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期373-379,共7页
构建了在甘丙肽2型受体(GalR2)N端带myc表位标签的真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。Western blot结果发现转染组myc-GalR2蛋白水... 构建了在甘丙肽2型受体(GalR2)N端带myc表位标签的真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。Western blot结果发现转染组myc-GalR2蛋白水平呈高表达。myc-GalR2主要分布在细胞膜上,少量分布于胞浆中。当给予甘丙肽(10-7mol/L)刺激后,5min时可见细胞膜上myc-GalR2明显减少,胞浆内myc-GalR2增多,15min时膜上myc-GalR2几乎全部消失。表明GalR2受体与配体结合后发生内化,且受体蛋白内化为时间依赖性的转运过程,证实在HEK293细胞GalR2会出现配体依赖性内化。同时,以已知膜蛋白5-HT1AR的内化作为对照,可见在给予甘丙肽刺激以后,5-HT1AR没有发生内化,受体蛋白仍然表达在膜上。此外,通过测定胞内钙水平激活情况来检测其信号通路激活情况,表明myc对GalR2功能没有明显影响。 展开更多
关键词 表位标签 甘丙肽2型受体(GalR2) G蛋白耦联受体(GPCRs) HEK293细胞 膜转运
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一种基于CRISPR技术的肺癌细胞基因标记方法
2
作者 黄缓缓 应杰 +2 位作者 王振毅 陈锦飞 韦栋平 《徐州医科大学学报》 CAS 2020年第5期337-343,共7页
目的建立基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的功能基因标签标记方法。方法通过分子无缝克隆技术构建Cas9核酸酶表达载体、[STBX]DCAF12[STBZ]基因特异的sgRNA表达载体以及双剪切型供体DNA载体;将上述质粒共同转染肺癌细胞A549... 目的建立基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的功能基因标签标记方法。方法通过分子无缝克隆技术构建Cas9核酸酶表达载体、[STBX]DCAF12[STBZ]基因特异的sgRNA表达载体以及双剪切型供体DNA载体;将上述质粒共同转染肺癌细胞A549,用嘌呤霉素抗性基因作为选择标记进行筛选。联合RNA干扰和Western blot技术鉴定[STBX]DCAF12[STBZ]基因是否被HA标签正确标记;后续用Cre重组酶切除胞内选择标记,并通过PCR和Western blot技术确认;最后通过细胞增殖试验和克隆存活试验鉴定[STBX]DCAF12[STBZ]基因标记对重组细胞生长的影响;用HA抗体进行免疫共沉淀试验,检测HA-DCAF12蛋白是否与胞内cullin-4-RING泛素连接酶(CRL4)复合体相关蛋白结合。结果RNA干扰和Western blot技术证实肺癌细胞[STBX]DCAF12[STBZ]基因能够被HA标签表位正确标记;胞内选择标记被剔除后,能够避免对内源[STBX]DCAF12[STBZ]基因表达的影响。细胞增殖与克隆存活试验证实[STBX]DCAF12[STBZ]基因被HA标签标记后没有影响细胞生长;免疫共沉淀试验证实HA-DCAF12蛋白能够与CRL4复合体中的cullin-4A及DDB1蛋白相结合,提示[STBX]DCAF12[STBZ]基因经HA标签标记后并未影响其自身生物学功能。结论本研究以肺癌细胞[STBX]DCAF12[STBZ]基因为例,成功建立一种通过表位标签简便、快捷标记功能基因的技术方法。 展开更多
关键词 CRISPR基因组编辑 表位标签 基因标记 融合表达
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表位标签技术在膜蛋白研究中的应用
3
作者 谢浩 郭小明 李其昌 《生命的化学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期771-774,共4页
膜蛋白的研究包括对膜蛋白在细胞内的运输和定位、膜蛋白的结构和功能、以及膜蛋白和其他蛋白质间的相互作用等方面的研究。在研究过程中,如果能够基于膜蛋白的拓扑学结构预测,选择合适的表位标签,利用基因融合技术在基因水平上对膜蛋... 膜蛋白的研究包括对膜蛋白在细胞内的运输和定位、膜蛋白的结构和功能、以及膜蛋白和其他蛋白质间的相互作用等方面的研究。在研究过程中,如果能够基于膜蛋白的拓扑学结构预测,选择合适的表位标签,利用基因融合技术在基因水平上对膜蛋白进行改造,可以产生含有表位标签的重组膜蛋白,不仅具有原有膜蛋白的功能活性,还能够被抗体特异性识别,并且结合相关的免疫荧光检测技术,将会极大地促进膜蛋白的结构和功能研究。本文就目前膜蛋白研究中所涉及的表位标签技术及其应用策略和所取得的进展作一简述。 展开更多
关键词 膜蛋白 表位标签 拓扑学结构
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重叠法联合长引物法构建具有HA标签的DJ-1 L166P突变体
4
作者 马幸 邓梅春 +1 位作者 陈汉春 朱飞舟 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第19期6-9,共4页
目的通过构建具有HA标签的DJ-1 L166P突变体(DJ-1 L166P-HA),建立一种快速构建具有标签的突变体的方法——重叠法联合长引物法。方法 PCR分别扩增DJ-1的N端和C端。扩增C端的反向引物DJ-1-HA-R包含HA标签的编码序列,是具有60个核苷酸的... 目的通过构建具有HA标签的DJ-1 L166P突变体(DJ-1 L166P-HA),建立一种快速构建具有标签的突变体的方法——重叠法联合长引物法。方法 PCR分别扩增DJ-1的N端和C端。扩增C端的反向引物DJ-1-HA-R包含HA标签的编码序列,是具有60个核苷酸的长引物。然后,DJ-1的N端和C端重叠延伸获得DJ-1 L166P-HA全长。最后,克隆DJ-1 L166P-HA至质粒pcDNA3.1(+)。结果只需一次连接反应,成功地构建了具有HA标签的DJ-1 L166P突变体的重组质粒pcDNA3.1(+)-DJ-1 L166P-HA。将该重组质粒转染HEK293细胞后,DJ-1 L166P-HA融合蛋白质成功表达。结论重叠法联合长引物法具有简便、快捷,易掌握等特点,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 基因克隆 定点突变 抗原表位标签 DJ-1 帕金森病
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