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VEGF-165基因修饰的MSCs诱导分化后治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究 被引量:2
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作者 田力 田晓晔 +2 位作者 范妮娜 梁晓鹏 于鑫琛 《沈阳医学院学报》 2009年第3期140-144,共5页
目的:探讨VEGF-165基因联合单纯骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)治疗激素性股骨头坏死的可行性。方法:1)体外分离、培养兔MSCs,纯化并鉴定兔MSCs;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后以1μgPcDNA3.1-hVEGF165... 目的:探讨VEGF-165基因联合单纯骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)治疗激素性股骨头坏死的可行性。方法:1)体外分离、培养兔MSCs,纯化并鉴定兔MSCs;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后以1μgPcDNA3.1-hVEGF165∶3μl阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染,通过ELISA检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。2)测定在正常条件培养和成骨条件培养下,转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。3)实验动物连续三天大剂量(40mg/kg)臀部肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠,通过MRI和组织病理学检查,建立动物模型。4)随机分成4组,每组14只。经皮穿刺于右侧股骨头,(1)生理盐水组,(2)单纯MSCs组,(3)hVEGF165基因转染MSCs组,(4)诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组。8周后,组织病理学检查成骨和细胞成活情况。结果:1)hVEGF165基因转染的MSCs能成功分泌VEGF蛋白。2)成骨条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组(P<0.05);而在正常条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。3)成功建立ANFH模型。4)组织学评分:生理盐水组1.8±0.72;单纯MSCs组8.54±0.37;hVEGF165基因转染MSCs组11.96±0.26;诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组13.7±0.43,各组间差异有显著性(P<0.05)。诱导分化转基因干细胞组与单纯干细胞组和生理盐水组之间差异非常显著(P<0.01)。结论:诱导分化后的hVEGF165基因转染MSCs组成骨能力更好,修复股骨头缺血性坏死的能力也是最强。 展开更多
关键词 股骨头缺血性坏死 骨髓间充质干细胞 血管内皮细胞生长因子165 诱导分化
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重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165快速构建及在骨髓移植小鼠体内的分布和表达效率 被引量:3
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作者 仲照东 邹萍 +1 位作者 游泳 黄士昂 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期35-38,F002,共5页
目的 研究增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF16 5 )重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率。方法 利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad EGFP hVEGF... 目的 研究增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF16 5 )重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率。方法 利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad EGFP hVEGF16 5 ;通过体外试验观察病毒的形态、滴度和安全性 ;经尾静脉注射 3× 10 8PFU的重组腺病毒给同基因骨髓移植BALB c小鼠 ,在不同时间检测重组腺病毒在小鼠体内分布和hVEGF16 5的表达。结果 通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad EGFP hVEGF16 5 ;纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一 ,滴度可达 10 1 0 ~ 10 1 1 PFU ml。Hela细胞感染病毒后经多次传代未见细胞病变。借助于荧光显微镜在不同时期观测到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠组织EGFP ;RT PCR分析和免疫组化染色显示脏器内有显著VEGF表达。各脏器未见明显毒性反应。ELISA法检测小鼠血浆中VEGF水平升高可达(86 6 6 7± 97 13)pg ml。结论 本研究结果证实细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点 ,并成功介导了hVEGF16 5基因在骨髓移植小鼠体内的安全、稳定表达 ,为今后在骨髓移植过程中开展基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 重组腺病毒 AdEGFP HVEGF165 骨髓移植 小鼠 血管内皮细胞生长因子165 载体 增强型绿色荧光蛋白
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改性丝素蛋白支架与生长因子基因修饰脂肪间充质干细胞构建组织工程脂肪 被引量:4
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作者 亢婷 王刚 +1 位作者 刘毅 刘刚强 《中国组织工程研究》 CAS CSCD 2014年第52期8450-8455,共6页
背景:构建工程化的脂肪组织,适宜的种子细胞和性能优良的支架材料缺一不可。目的:探讨携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞后,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体外构建组织工程脂肪的可行性。方法... 背景:构建工程化的脂肪组织,适宜的种子细胞和性能优良的支架材料缺一不可。目的:探讨携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞后,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体外构建组织工程脂肪的可行性。方法:选取生长良好的第3代人脂肪间充质干细胞,用携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒进行感染。将慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞成脂诱导14 d,油红O染色观察细胞的成脂能力;将慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞分别接种于壳聚糖修饰丝素蛋白支架材料上,MTT法检测细胞增殖能力;成脂诱导14 d后进行油红O染色,RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶增殖物活化受体γ2的表达。结果与结论:成脂诱导14 d后,慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞均可见成熟脂肪细胞,组间差异不明显。慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞在改性丝素蛋白支架的生长曲线相近;成脂诱导后,油红O染色及RT-PCR均显示生成大量成熟脂肪细胞。表明携带重组人血管内皮细胞生长因子基因的慢病毒感染人脂肪间充质干细胞后,不影响其生长及成脂能力,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料可成功构建组织工程化脂肪。 展开更多
关键词 生物材料 材料相容性 人脂肪间充质干细胞 慢病毒载体 血管内皮细胞生长因子165 改性丝素蛋白
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携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达 被引量:2
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作者 张金康 孟国林 +8 位作者 刘建 胡蕴玉 袁志 段春光 毕龙 白峰 黄鑫 禚文昆 李国臣 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期312-315,共4页
[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克... [目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P<0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。 展开更多
关键词 血管内皮细胞生长因子165 血管生成素-1 腺病毒载体 基因转染
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腺病毒介导人VEGF_(165)和ANG-1双基因转染大鼠BMSCs及对其增殖的影响 被引量:2
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作者 张金康 孟国林 +6 位作者 刘建 胡蕴玉 袁志 段春光 白峰 白建萍 李丹 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期934-938,共5页
[目的]探讨携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因的腺病毒表达载体pAd-VIA转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外表达及对BMSCs增殖的影响。[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因的腺病毒质粒pAd... [目的]探讨携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因的腺病毒表达载体pAd-VIA转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外表达及对BMSCs增殖的影响。[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因的腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,体外转染大鼠BMSCs,通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、Western-blotting、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测外源基因的表达,利用MTT法检测MOI(multiplicity of infection)=50、100、200、400 pfu/cell不同浓度腺病毒转染后对BMSCs增殖活性的影响。[结果]重组腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,体外转染BMSCs后,有大量的GFP表达,Western-blotting检测显示,转染组与VEGF165和ANG-1抗体结合,在45 KD和14.4 KD左右出现印迹条带;ELISA结果显示:转染组第1、2、3 d,上清中的VEGF165浓度和ANG-1浓度持续增加,未转染组均未检测到外源基因的表达,差异有统计学意义(P<0.01);不同浓度的腺病毒载体转染BMSCs后,促进细胞增殖,细胞生长曲线上移,在1、3、5、7 d转染组的OD值均大于未转染组,差异有统计学意义(P<0.01),第9 d,细胞进入平台期,转染组和未转染组的OD值差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]重组腺病毒pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,外源基因在体外得到有效表达,同时在观察时间内可以促进大鼠BMSCs的增殖。 展开更多
关键词 血管内皮细胞生长因子165 血管生成素-1 骨髓基质干细胞 增殖
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pVEGF165-IRES-Ang-1重组质粒的构建及双基因表达研究
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作者 罗源李 熊成龙 朱峰 《老年医学与保健》 CAS 2014年第6期384-388,426,共6页
目的 探讨pVEGF165-IRES-Ang-1重组双顺反子质粒在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSC)中表达的情况,为下一步的动物实验奠定基础.方法 构建插入人血管生成素-1(angiopoietin,Ang-1)和人血管内皮... 目的 探讨pVEGF165-IRES-Ang-1重组双顺反子质粒在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSC)中表达的情况,为下一步的动物实验奠定基础.方法 构建插入人血管生成素-1(angiopoietin,Ang-1)和人血管内皮细胞生长因子165 (vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)双顺反子的pIRES重组质粒,经脂质体转染大鼠MSC,以实时荧光定量PCR技术分析各基因人源、鼠源以及总mRNA的动态变化.结果 所构建的pVEGF165-IRES-Ang-1双顺反子重组质粒在大鼠MSC中成功表达了相应蛋白.人VEGF165得以高丰度表达,且在转染1d后mRNA检出的拷贝数最高;人Ang-1在4个检测时间点中的mRNA拷贝数比较稳定,但转录本的拷贝数较VEGF 165显著降低;转入人Ang-1和人VEGF 165后,各对应同源蛋白的总mRNA有显著增加,但大鼠MSC自身Ang-1与VEGF164的编码mRNA明显有下调趋势.结论 pVEGF165-IRES-Ang-1重组双顺反子质粒双基因表达量明显不一致,表现为受插入的位置关系影响,且可能受转染细胞内同源蛋白的总量调控. 展开更多
关键词 双顺反子 质粒 骨髓间充质干细胞 血管生成素-1 血管内皮细胞生长因子165 同源蛋白
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血管内皮生长因子165b对人肝癌HepG_2细胞生物学特性的影响 被引量:8
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作者 赵燕颖 王秀岩 +3 位作者 秦国涛 孙远杰 刘志忠 李然伟 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期101-105,共5页
目的:探讨血管内皮生长因子165b(VEGF165b)对人肝癌HepG_2细胞生物学特性的影响,并初步研究其作用机制。方法:HepG_2细胞分为空白组(仅加转染试剂)、对照组(转染阴性对照PcDNA3.0表达载体)和PcDNA-VEGF165b组(转染VEGF165b表达载体PcDNA... 目的:探讨血管内皮生长因子165b(VEGF165b)对人肝癌HepG_2细胞生物学特性的影响,并初步研究其作用机制。方法:HepG_2细胞分为空白组(仅加转染试剂)、对照组(转染阴性对照PcDNA3.0表达载体)和PcDNA-VEGF165b组(转染VEGF165b表达载体PcDNA-VEGF165b)。MTT法检测各组HepG_2细胞生存率,RT-PCR法和Western blotting法检测HepG_2细胞中VEGF165b和VEGF165 mRNA和蛋白表达水平,Transwell小室法检测HepG_2细胞迁移能力。结果:与空白组比较,对照组HepG_2细胞中VEGF165b和VEGF165mRNA和蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。与空白组比较,PcDNA-VEGF165b组细胞中VEGF165bmRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05),VEGF165 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。空白组和对照组细胞生存率比较差异无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,PcDNAVEGF165b组细胞生存率有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。细胞迁移实验,空白组和对照组细胞迁移率比较差异无统计学意义(P<0.05);与空白组和对照组比较,PcDNA-VEGF165b组HepG_2细胞迁移率明显降低(P<0.05)。结论:VEGF 165b能抑制VEGF165基因和蛋白的表达,VEGF165b对肝癌细胞增殖无明显影响,但可降低肝癌细胞的迁移能力。 展开更多
关键词 肝肿瘤 HEPG2细胞 血管内皮细胞生长因子165b 血管内皮细胞生长因子165 细胞增殖 细胞迁移
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VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达 被引量:2
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作者 王刚 刘成硅 +2 位作者 张晓明 张凯伦 蒋雄刚 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期55-59,共5页
目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到... 目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 血管内皮细胞生长因子165 人组织型纤溶酶原激活因子 真核表达载体 体外表达
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VEGF基因治疗动脉硬化性闭塞症的足甲襞微循环变化
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作者 高桂琴 刘杏香 曹薇 《中国微循环》 北大核心 2005年第6期419-421,共3页
目的观察患肢足大趾甲襞微循环血流状态、管襻形态及襻周状态以判断编码血管内皮细胞生长因子165的腺病毒载体(Ad-VEGF165)基因促进动脉硬化性闭塞症(Arteriosc lerosis ob literans,ASO)患者的患肢血管新生的疗效。方法将确诊的6例ASO... 目的观察患肢足大趾甲襞微循环血流状态、管襻形态及襻周状态以判断编码血管内皮细胞生长因子165的腺病毒载体(Ad-VEGF165)基因促进动脉硬化性闭塞症(Arteriosc lerosis ob literans,ASO)患者的患肢血管新生的疗效。方法将确诊的6例ASO患者的8条患肢血管狭窄严重或闭塞部位的肌肉内注射Ad-VEGF165 4.0×1012cfu(病毒颗粒/毫升),注射前后进行以下观察:临床症状、体征;足甲襞微循环;下肢核磁共振血管成像(MRA);下肢彩色多普勒超声;血液流变学。结果6例8条肢体中临床显效4条,占50%,有效3条,占37.5%,无效1条,占12.5%。一月后所有经基因治疗的患肢足大趾甲襞微循环管襻数目增多,血流速度增快,红细胞聚集减轻,管襻周围渗出减轻。各项积分值较治疗前均有明显降低(P<0.05)。结论足大趾甲襞微循环,较手指甲襞微循环更能反应下肢的末梢循环改变,证实了Ad-VEGF165具有促进血管新生的作用。 展开更多
关键词 动脉硬化性闭塞症 甲襞微循环 血管内皮细胞生长因子165基因治疗
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