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蜜蜂残翼病毒TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：5
1
作者 王琛 马跃宇 +6 位作者 黄思超 孙莉 李明 韩喜彬 高志峰 费东亮 马鸣潇 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期686-694,共9页
蜜蜂残翅病毒(Deform wing virus,DWV)已成为世界上最著名、分布最广、研究最为深入的昆虫病原。虽然DWV以前存在于蜜蜂种群中,但一种新的媒介—外寄生螨Varroa破坏体的到来和全球传播,极大地促进了DWV的流行病学。为了建立快速、准确... 蜜蜂残翅病毒(Deform wing virus,DWV)已成为世界上最著名、分布最广、研究最为深入的昆虫病原。虽然DWV以前存在于蜜蜂种群中,但一种新的媒介—外寄生螨Varroa破坏体的到来和全球传播,极大地促进了DWV的流行病学。为了建立快速、准确且能定量分析的蜜蜂残翅病毒,DWV检测方法,本研究参照GenBank中已登录的DWV高度保守的3C-RdRp基因区域,设计了1对特异性引物和带有羧基荧光素(Fast Auxiliary Memory,FAM)与淬灭基团(Eclipse)标记的TaqMan探针,并对反应条件进行优化,建立了检测DWV的TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法(TaqMan qRT-PCR),同时对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行了试验,并对临床样品进行检测。结果显示:该方法最佳上下游引物和探针浓度分别为12.5μmol/L和10μmol/L,最佳退火温度为59℃;敏感性试验中,对DWV质粒标准品检测下限为2.58×10^(1)拷贝/μL;本方法特异性较好,对蜜蜂常见病毒—蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、蜜蜂急性麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)和中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)无交叉反应;且批内变异系数和批间变异系数均小于2%。利用该方法对49份临床疑似样本进行检测,其中DWV阳性样本为35份,检出率高于常规RTPCR方法,且病毒载量大于1×10^(7)拷贝/只样本数共24份,表明辽宁和河北部分地区感染DWV蜂群中病毒载量较高,流行情况比较严重。因此,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,能够用于DWV病原监测、流行病学调查和病毒定量分析等相关研究。 展开更多
关键词 蜜蜂残翼病毒(dwv) TAQMAN-MGB探针 qRT-PCR方法 临床检测
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锦州地区一例蜜蜂残翼病的RT-PCR诊断与蜜蜂残翼病毒的鉴定及同源性分析 被引量：2
2
作者 张皓淳 张鑫 +3 位作者 杨作丰 马建山 邓文超 王冰 《现代畜牧兽医》 2017年第8期17-22,共6页
为确诊锦州某蜂场蜜蜂大量死亡病因,本试验采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,收集病死蜜蜂提取总RNA,进行反转录,获得c DNA。然后,以c DNA为模板,利用检测常见蜜蜂病毒的引物进行PCR扩增。结果表明,从蜜蜂病料中扩增出编码蜜蜂残翅... 为确诊锦州某蜂场蜜蜂大量死亡病因,本试验采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,收集病死蜜蜂提取总RNA,进行反转录,获得c DNA。然后,以c DNA为模板,利用检测常见蜜蜂病毒的引物进行PCR扩增。结果表明,从蜜蜂病料中扩增出编码蜜蜂残翅病毒Helicase蛋白酶的基因片段,大小约702 bp,将分离毒株命名为DWV-JZ。测序结果通过BLAST比对以及与Gen Bank中获得的7个序列进行遗传进化分析,证实DWV-JZ与Gen Bank中的DWV-JL1(KP096414.1)同源性达到95%,亲缘关系最近。 展开更多
关键词 蜜蜂残翼病毒(dwv) RT-PCR 诊断 遗传进化分析
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蜜蜂残翼病毒VP2基因密码子优化、原核表达及免疫原性分析 被引量：1
3
作者 郭亚茜 王灏琦 +5 位作者 费东亮 马跃宇 樊琼 黄思超 王琛 马鸣潇 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期255-263,共9页
蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)是引发世界各地大范围蜂群损失的主要嫌疑对象,间接给农业生产带来了巨大的经济损失。为了探究DWV结构蛋白VP2的免疫原性,深入研究该蛋白的功能和为制备DWV单克隆抗体提供可靠的免疫原,本研究从DW... 蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)是引发世界各地大范围蜂群损失的主要嫌疑对象,间接给农业生产带来了巨大的经济损失。为了探究DWV结构蛋白VP2的免疫原性,深入研究该蛋白的功能和为制备DWV单克隆抗体提供可靠的免疫原,本研究从DWV分离株(GenBank登录号:MF770715)扩增得到VP2基因,同时根据大肠杆菌密码子的偏嗜性对VP2基因进行优化并合成,分别将优化前和优化后的VP2基因克隆到pET-28a载体上,获得重组质粒pET-28a-VP2和pET-28a-opti-VP2,分别转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测,显示仅优化后的opti-VP2基因高效表达,然后对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,对重组蛋白纯化后分3次免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,同时设置纯化病毒组和空白对照组,对免疫小鼠的抗体水平和淋巴细胞增殖指数(SI)以及干扰素(IFN-γ)、白介素IL-2和IL-4水平进行检测。结果表明,重组VP2蛋白能够诱导产生特异性抗体,促进淋巴细胞增殖,提高IFN-γ、IL-2和IL-4水平,具有良好的免疫原性,为深入研究DWV VP2蛋白功能和开发防治DWV的生物制剂提供了帮助。 展开更多
关键词 蜜蜂残翼病毒(dwv) VP2基因 优化 原核表达 免疫原性
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蜜蜂残翼病毒RT-PCR检测及衣壳蛋白VP1基因的序列分析
4
作者 隋佳辰 于寒松 +5 位作者 代佳宇 王向辉 郑言 杨倩 宋战昀 张建 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第12期157-159,共3页
为了研究蜜蜂残翼病毒(DWV)的遗传变异特点,试验从吉林某地蜂场疑似蜜蜂残翼病的病蜂中初步分离得到1株DWV毒株,采用RT-PCR技术扩增VP1基因并对其进行检验分析。结果表明:基因测序结果与Gen Bank中的DWV毒株衣壳蛋白VP1基因序列同源性为... 为了研究蜜蜂残翼病毒(DWV)的遗传变异特点,试验从吉林某地蜂场疑似蜜蜂残翼病的病蜂中初步分离得到1株DWV毒株,采用RT-PCR技术扩增VP1基因并对其进行检验分析。结果表明:基因测序结果与Gen Bank中的DWV毒株衣壳蛋白VP1基因序列同源性为99%左右;将此分离毒株DWV的VP1基因核苷酸序列与Gen Bank中的10个序列进行系统遗传进化树分析,证实其与AB070959.1、NC_005876.1的同源性最近,而与HM067437.1、KJ437447.1的同源性最低。 展开更多
关键词 蜜蜂残翼病毒(dwv) VP1基因 RT—PCR 克隆 序列分析 进化树分析
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