枯草杆菌碱性蛋白酶E的纯化和性质 被引量：13

1

作者 王贤舜 路阳 +4 位作者 张治洲 邓力 李冰 施建平 王培之 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1992年第5期398-400,共3页

目前国内外研究较多的是地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)碱性蛋白酶Carlsberg和解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)碱性蛋白酶BPN’的纯化。鉴于蛋白酶E和蛋白酶BPN’在结构上有15％的非同源性,故我们用修饰纯化蛋白酶BP... 目前国内外研究较多的是地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)碱性蛋白酶Carlsberg和解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)碱性蛋白酶BPN’的纯化。鉴于蛋白酶E和蛋白酶BPN’在结构上有15％的非同源性,故我们用修饰纯化蛋白酶BPN’的方法来纯化蛋白酶E(subtilisin E)。 展开更多

关键词 蛋白酶e 层析分离 枯草杆菌

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用蛋白质工程的方法改良枯草杆菌蛋白酶E(Subtilisin E)的抗氧化性 被引量：5

2

作者 王培之 王贤舜 +1 位作者 孔丽云 李党生 《生物化学杂志》 CSCD 1992年第5期541-546,共6页

以含有蛋白酶E基因(aprE)的单链M13mp18-aprE DNA为模板,合成的寡核苷酸5′-3′为诱变引物,用缺口双链法对aprE进行Met-222-Ala点突变。经菌落印迹杂交筛选,选出阳性噬斑。用SaⅡ酶解M13mp18-aprE得到aprE,将它和pPZW103重组,转化中性... 以含有蛋白酶E基因(aprE)的单链M13mp18-aprE DNA为模板,合成的寡核苷酸5′-3′为诱变引物,用缺口双链法对aprE进行Met-222-Ala点突变。经菌落印迹杂交筛选,选出阳性噬斑。用SaⅡ酶解M13mp18-aprE得到aprE,将它和pPZW103重组,转化中性、碱性蛋白酶缺失宿主菌DB104。经含卡那霉素和脱脂奶粉板筛选和比较aprE限制性内切酶NcoⅠ和SacⅡ水解电泳图谱分析,完成构建一个分泌抗氧化的枯草杆菌蛋白酶E的工程菌PW8888。 展开更多

关键词 蛋白酶e 抗氧化性 枯草杆菌

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枯草杆菌蛋白酶E的156和165位突变 被引量：2

3

作者 陈为东 马建华 朱榴琴 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1997年第4期331-334,共4页

应用定点突变方法 ,在M2 2 2A突变的枯草杆菌蛋白酶E基因上进行E1 56S和V1 65I定点突变 .将突变基因插入大肠杆菌 枯草杆菌穿梭质粒 pBE 2中 ,在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌DB1 0 4中进行表达 ,得到突变种 (M 2 2 2A ,E1 56S)和 (... 应用定点突变方法 ,在M2 2 2A突变的枯草杆菌蛋白酶E基因上进行E1 56S和V1 65I定点突变 .将突变基因插入大肠杆菌 枯草杆菌穿梭质粒 pBE 2中 ,在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌DB1 0 4中进行表达 ,得到突变种 (M 2 2 2A ,E1 56S)和 (M 2 2 2A ,E1 56S ,V1 65I)蛋白酶E .性质测定表明 ,E1 56S突变使蛋白酶比活力增加 90 % ,并不影响酶的热稳定性和抗氧化性 .而V1 展开更多

关键词 枯草杆菌 蛋白酶e 稳定性 突变

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枯草杆菌蛋白酶E的结晶及初步衍射研究

4

作者 周岚 师珂 +3 位作者 储乃明 毕汝昌 邓立 李冰 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 1992年第2期252-254,共3页

对来源于枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶E进行了初步晶体学研究。应用悬滴汽相扩散法生长出了该酶的单晶体,其空间群为P2_12_12_1,晶胞边长a=74.35A,b=80.98A,c=88.59A。已用面探测器衍射仪收集了一套中等分辨率的X射线衍射数据。

关键词 枯草杆菌 蛋白酶e 衍射 结晶

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分子力学在模拟蛋白酶定位突变效应中的应用

5

作者 晁阳 储乃明 毕汝昌 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 1993年第10期20-22,共3页

关键词 突变 蛋白酶e 静电 分子动力学

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热稳定和抗氧化的枯草杆菌蛋白酶E双突变体(M222A,N118S)的结晶和初步晶体学研究

6

作者 季永梅 李平卫 +1 位作者 朱榴琴 毕汝昌 《生物物理学报》 CSCD 北大核心 1997年第4期541-544,共4页

对具有热稳定和抗氧化性质的枯草杆菌蛋白酶Ｅ双突变体（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ）进行了初步晶体学研究。应用悬滴式汽相扩散法生长出了该酶突变体的单晶体，蛋白酶抑制剂对防止酶自溶、稳定蛋白质构象和生长出合用的单晶体起到了重要... 对具有热稳定和抗氧化性质的枯草杆菌蛋白酶Ｅ双突变体（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ）进行了初步晶体学研究。应用悬滴式汽相扩散法生长出了该酶突变体的单晶体，蛋白酶抑制剂对防止酶自溶、稳定蛋白质构象和生长出合用的单晶体起到了重要作用。该晶体的空间群为Ｐ２１，晶胞参数为ａ＝５３．０５，ｂ＝７４．８４，ｃ＝６８．７４，β＝９７．２４°，每个不对称单位里含两个分子。已用面探测器衍射仪收集了一套２．５分辨率的Ｘ射线衍射数据。 展开更多

关键词 枯草杆菌 蛋白酶e 突变体 热稳定性 结晶 晶体学

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枯草杆菌蛋白酶E的分子置换研究

7

作者 储乃明 师珂 毕汝昌 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 1993年第17期1606-1609,共4页

枯草杆菌蛋白酶是产生于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶。该类酶的肽链折叠方式完全不同于哺乳动物丝氨酸蛋白酶,但两者起催化作用的残基都是一样的,并具有几乎完全相同的空间配置,因而属两类不同的丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶的结构和功... 枯草杆菌蛋白酶是产生于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶。该类酶的肽链折叠方式完全不同于哺乳动物丝氨酸蛋白酶,但两者起催化作用的残基都是一样的,并具有几乎完全相同的空间配置,因而属两类不同的丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶的结构和功能受到了深入研究,该酶还具备其它一些开展蛋白质工程研究的有利条件,它还是一种重要工业用酶,大量用作合成洗涤剂中降解蛋白质的组分。因此。 展开更多

关键词 枯草杆菌 蛋白酶e 分子置换法

原文传递

大鼠胰星状细胞的分离与培养 被引量：8

8

作者 贾一韬 李兆申 《胰腺病学》 2003年第3期158-161,共4页

目的　建立大鼠胰星状细胞 (pancreatic stellate cells,PSCs)的分离培养方法。方法　大鼠胰腺组织经胶原酶和链霉蛋白酶 E消化后 ,用 Nycodenz不连续密度梯度离心法分离 PSC,在 32 8nm紫外光激发下观察细胞的自发荧光现象 ,并以免疫组... 目的　建立大鼠胰星状细胞 (pancreatic stellate cells,PSCs)的分离培养方法。方法　大鼠胰腺组织经胶原酶和链霉蛋白酶 E消化后 ,用 Nycodenz不连续密度梯度离心法分离 PSC,在 32 8nm紫外光激发下观察细胞的自发荧光现象 ,并以免疫组化技术检测结蛋白 (desmin)、神经胶质原纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein,GFAP)和α-平滑肌动蛋白 (α- sm ooth m uscle actin,α- SMA )的表达 ,同时观察培养细胞的形态和生长特性。结果　新鲜分离的大鼠 PSCs产率、活力和纯度分别约为 2 .5 ×10 6 /g胰腺、95 %和 90 %。培养的 PSCs可自发活化 ,表达 α- SMA,细胞由静止型转化为肌成纤维样细胞表型。原代培养 10天后细胞纯度 >95 % ,传代培养后细胞纯度可达 99%以上。结论　利用 Nycodenz密度梯度离心方法可成功分离大鼠 PSCs,其细胞产率、活力和纯度均可满足体外研究需要。 展开更多

关键词 大鼠 胰星状细胞 分离 培养 胰腺组织经胶原酶 链霉蛋白酶e

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刺参2种天冬氨酸蛋白酶的酶学性质及其对自溶的影响 被引量：5

9

作者 王玲 年益莹 +5 位作者 薛鹏 季晓彤 崔钰婷 张公亮 侯红漫 孙黎明 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第14期99-105,共7页

对刺参体内2种天冬氨酸蛋白酶——组织蛋白酶D(cathepsin D,Cat D)和组织蛋白酶E(Cat E)的酶学性质进行探讨,并考察两者可能在刺参自溶中的参与作用。先用Tris-HCl缓冲溶液提取刺参体壁中的粗酶,采用特异性荧光底物法测定Cat D和Cat E... 对刺参体内2种天冬氨酸蛋白酶——组织蛋白酶D(cathepsin D,Cat D)和组织蛋白酶E(Cat E)的酶学性质进行探讨,并考察两者可能在刺参自溶中的参与作用。先用Tris-HCl缓冲溶液提取刺参体壁中的粗酶,采用特异性荧光底物法测定Cat D和Cat E的酶学性质。结果表明,Cat D和Cat E的最适pH值分别为5.0和4.0,分别在60℃和40℃呈现最大酶活性,两者在20~40℃活性均较为稳定。Zn^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)、Fe^(3+)、Mn^(2+)可抑制CatD的活性,抑制率分别为86%、76.3%、29.2%、56.5%和48.5%。Fe^(3+)、Fe^(2+)、Cu^(2+)可抑制Cat E的活力,抑制率分别为99.1%、82.2%和28.6%。Pepstatin A、Z-Leu-Leu-Leu-H、苯甲基磺酸氟、1,10-菲啰啉能够抑制两者活性,抑制率分别约为98%~99%、65%~78%、30%~35%、19%~23%。二硫苏糖醇、L-Cys和乙二胺四乙酸则可将两者活性分别提升30.4%~31.1%、7.58%~9.64%、6.6%~7.9%。结果表明,刺参Cat D和Cat E为2种具有一定金属离子敏感性和依赖性的天冬氨酸蛋白酶,其活性中心有丝氨酸和半胱氨酸参与其活性调节,且两者很有可能参与刺参自溶过程中蛋白质的降解。 展开更多

关键词 刺参 天冬氨酸蛋白酶 组织蛋白酶D 组织蛋白酶e 酶学性质 自溶

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枯草杆菌蛋白酶E的蛋白质工程 被引量：3

10

作者 朱榴琴 季永梅 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第1期13-17,共5页

用定点突变和随机突变的方法，对枯草杆菌碱性蛋白酶Ｅ基因进行改造。突变后的基因插入大肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒ｐＢＥ２中，在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌ＤＢ１０４中进行表达，得到突变种的碱性蛋白酶，它们的突变位点分... 用定点突变和随机突变的方法，对枯草杆菌碱性蛋白酶Ｅ基因进行改造。突变后的基因插入大肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒ｐＢＥ２中，在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌ＤＢ１０４中进行表达，得到突变种的碱性蛋白酶，它们的突变位点分别是（Ｍ２２２Ａ）、（Ｍ２２２Ａ、Ｎ１１８Ｓ）、（Ｍ２２２Ａ、Ｎ１１８Ｓ、Ｑ１０３Ｒ）、（Ｍ２２２Ａ、Ｎ１１８Ｓ、Ｑ１０３Ｒ、Ｄ６０Ｎ）。各突变种酶的性质测定结果表明，Ｍ２２２Ａ突变使酶抗氧化，Ｎ１１８Ｓ突变使酶增加热稳定性，Ｑ１０３Ｒ和Ｄ６０Ｎ突变虽然能增加酶的比活，但使酶的热稳定性大大下降，尤其是Ｄ６０Ｎ突变使酶变得极不稳定。野生型碱性蛋白酶与（Ｍ２２２Ａ）突变种的等电点均为８９２，而（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ），（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ，Ｑ１０３Ｒ）和（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ，Ｑ１０３Ｒ，Ｄ６０Ｎ）突变酶分别为８８８，９１０和９１７。用ＮｓｕｃＡＡＰＦｐＮＡ作为底物时酶反应最适ｐＨ值为７５～９５，而用酪蛋白作底物时最适ｐＨ值为１０～１２。 展开更多

关键词 枯草杆菌 碱性蛋白酶e 蛋白质工程

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超声辅助酶法提取-液相色谱-原子荧光光谱法测定富硒黑木耳中硒形态 被引量：4

11

作者 刘笑笑 金秋 +3 位作者 张振都 张奇 宋志峰 魏春雁 《中国无机分析化学》 CAS 北大核心 2022年第1期163-170,共8页

建立了富硒黑木耳中硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸、亚硒酸、硒蛋氨酸、硒酸5种硒形态的液相色谱-原子荧光光谱分析方法。通过链酶蛋白酶E酶解,结合超声提取后,选取Hamilton PRP-X100离子交换色谱柱(250 mm×4.1 mm,10μm),40 mmol/L的... 建立了富硒黑木耳中硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸、亚硒酸、硒蛋氨酸、硒酸5种硒形态的液相色谱-原子荧光光谱分析方法。通过链酶蛋白酶E酶解,结合超声提取后,选取Hamilton PRP-X100离子交换色谱柱(250 mm×4.1 mm,10μm),40 mmol/L的磷酸氢二铵为流动相,在16 min内,5种硒形态完全达到基线分离。5种硒形态在线性范围内相关系数R为0.9990~0.9999;加标回收率为76.1%~108%;检出限分别为硒代胱氨酸0.35μg/L、甲基-硒代半胱氨酸0.46μg/L、亚硒酸0.26μg/L、硒代蛋氨酸0.64μg/L、硒酸3.06μg/L;方法应用于富硒黑木耳中硒形态的分析,精密度高、重现性好、方法稳定、准确可靠,是测定富硒黑木耳中硒形态含量的有效方法。 展开更多

关键词 原子荧光光谱法 酶法 硒形态 富硒黑木耳 链酶蛋白酶e

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矽肺大鼠差异表达基因的筛选与验证 被引量：2

12

作者 徐慧蓉 王献华 +4 位作者 马小兵 侯文娜 朱兰 向聚才 孙瑞军 《中华劳动卫生职业病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期45-51,共7页

目的 筛选矽肺大鼠肺组织与正常大鼠肺组织的差异表达基因,并对差异表达基因基质金属蛋白每-12（MMP-12）和组织蛋白酶E（Cathepsin E）进行鉴定,探讨其在矽肺发病中的作用.方法 将健康SD大鼠随机分为模型组（24只）和对照组（6只）,采... 目的 筛选矽肺大鼠肺组织与正常大鼠肺组织的差异表达基因,并对差异表达基因基质金属蛋白每-12（MMP-12）和组织蛋白酶E（Cathepsin E）进行鉴定,探讨其在矽肺发病中的作用.方法 将健康SD大鼠随机分为模型组（24只）和对照组（6只）,采用非气管暴露法建立雄性SD大鼠矽肺模型,HE染色和VG染色进行肺组织病理观察.对染尘60d的大鼠肺组织,应用基因芯片筛选大鼠肺组织中的差异表达基因.选择明显上调的MMP-12和Cathepsin E基因,用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫组织化学法及蛋白质印迹（Western blot）法进行鉴定.结果 从26 962个基因中共筛选出模型组和对照组的差异表达基因338个,其中上调基因267个,下调基因71个.经RT-PCR验证,染尘后30、60、90d时,模型组大鼠肺组织中MMP-12 mRNA表达的吸光度值分别为对照组的4.306、5.338、6.713倍,Cathepsin E分别为1.434、2.974、3.889倍.经免疫组织化学法验证,染尘后30、60、90 d时,模型组大鼠肺组织中MMP-12蛋白表达的平均吸光度值分别为对照组的1.435、1.746、2.069倍,Cathepsin E分别为1.372、1.663、2.103倍.经Western blot法验证,染尘后30、60、90d时,模型组大鼠肺组织中MMP-12蛋白表达的平均吸光度值分别为对照组的1.214、1.531、1.959倍,Cathepsin E分别为1.262、1.828、1.907倍.与对照组相比,模型组大鼠肺组织中MMP-12和Cathepsin E mRNA和蛋白表达量明显上调,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 应用基因芯片筛选出矽肺大鼠肺组织差异表达基因并得以验证,MMP-12和Cathepsin E可能通过降解肺泡壁基底膜及参与免疫应答等参与矽肺的发生发展过程. 展开更多

关键词 矽肺 基因表达 基质金属蛋白酶 组织蛋白酶e

原文传递

胰岛素样生长因子1、载脂蛋白酶E基因多态性与阿尔茨海默病关系的研究 被引量：3

13

作者 李芳芳 王建平 蒋超 《中风与神经疾病杂志》 北大核心 2017年第8期696-699,共4页

目的探讨河南省汉族人群胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)基因rs972936位点多态性、载脂蛋白酶E(Apo E)基因多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)之间的相关性。方法选取58例AD患者和126例年龄、性别... 目的探讨河南省汉族人群胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)基因rs972936位点多态性、载脂蛋白酶E(Apo E)基因多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)之间的相关性。方法选取58例AD患者和126例年龄、性别相匹配的健康对照(ND)者为研究对象,柱层析法提取外周血基因组DNA,采用PCR和基因测序技术检测IGF-1基因rs972936位点及Apo E基因型多态分布,并进行对比分析。结果与ND组比较,AD组IGF-1基因rs972936位点3种基因型分布总体差异有统计学意义(χ~2=6.108,P=0.047),其中AD组中GG基因型的频率高于对照组(70.7%>51.6%,χ~2=5.935,P=0.015),G等位基因频率明显高于健康对照组(χ~2=6.502,P=0.011);AD组Apo Eε4等位基因频率可能增加AD的患病风险(OR=2.872,95%CI 1.542~5.351)(P=0.001);Apo Eε4等位基因不影响IGF-1基因rs972936位点的基因型或等位基因的分布频率(P>0.05)。结论 IGF-1基因rs972936位点多态性与河南汉族人群AD的发病可能有相关性,其中GG基因型、G等位基因可能是AD发病的独立于Apo Eε4等位基因的危险因素。Apo Eε4等位基因是散发性AD的主要危险因素。 展开更多

关键词 胰岛素样生长因子1基因 载脂蛋白酶e基因 基因多态性 阿尔茨海默病 汉族

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一种天门冬氨酸蛋白酶活性部位基序中酸性氨基酸的作用 被引量：1

14

作者 刘剑 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2009年第28期5558-5561,共4页

背景:组织蛋白酶E是一种细胞内天门冬氨酸蛋白酶,属于胃蛋白酶家族,它由两个同源结构域组成,每个结构域含有一个保守基序DTG,其中第98位天门冬氨酸残基的作用尚属未知。目的:检验第98位天门冬氨酸残基的重要性。设计、时间及地点:观察实... 背景:组织蛋白酶E是一种细胞内天门冬氨酸蛋白酶,属于胃蛋白酶家族,它由两个同源结构域组成,每个结构域含有一个保守基序DTG,其中第98位天门冬氨酸残基的作用尚属未知。目的:检验第98位天门冬氨酸残基的重要性。设计、时间及地点:观察实验,于2007-11/2008-12在广东药学院完成。材料:参照文献方法制备大鼠组织蛋白酶E抗体,并通过亲色谱法纯化。PcDNA3.0由广州英韦创津生物科技有限公司提供。人胚肾293细胞株由中科院上海细胞库提供。方法:在SmaⅠ和XhoⅠ间将含有全长大鼠组织蛋白酶E的cDNA插入pBluescriptIISK-质粒中。通过Kunkel基因定点突变方法,将大鼠组织蛋白酶E内第98位天门冬氨酸残基用另一种酸性氨基酸,谷氨酸替代,构建成变异体D98E,并在人胚胎肾细胞中进行表达。主要观察指标:观察野生型和变异体蛋白的表达,将野生型和变异体组织蛋白酶E蛋白纯化,对变异体组织蛋白酶E的酶活性、折叠及自我加工等进行分析。结果:当将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在人胚胎肾293细胞中进行异源表达时,在细胞培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达。突变体D98E仍具有自我转化为成熟型酶的能力,尽管它们的酶活性只是野生型的13%。变异体的Km值与野生型的相似,但它的Kcat值却比野生型显著下降。变异体和野生型酶都被胃酶抑素和蛔虫胃蛋白酶抑制剂所抑制,Ki值几乎相同。变异体在各种酸碱度下的圆二色光谱与野生型基本相同。结论:第98位苏氨酸残基对酶的催化活性确实非常重要,其可被谷氨酸部分替代,其变异体D98E酶催化活性下降。原因与变异导致变异体水解底物的效率下降有关。 展开更多

关键词 活性部位基序 天门冬氨酸蛋白酶 组织蛋白酶e 变异体解析

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非纯培养物细菌蛋白酶DNA片段的克隆与表达(英文)

15

作者 葛琴雅 唐成康 +2 位作者 唐建华 范兆心 张义正 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期550-554,共5页

为了构建更多的蛋白酶基因工程菌，以及进行蛋白酶基因的直接进化研究，从非纯培养细菌总DNA中扩增各种编码蛋白酶的DNA片段．根据MEROPS和GenBank数据库中的枯草杆菌类蛋白酶的编码区和成熟肽编码序列设计并合成了10条引物．富集培养... 为了构建更多的蛋白酶基因工程菌，以及进行蛋白酶基因的直接进化研究，从非纯培养细菌总DNA中扩增各种编码蛋白酶的DNA片段．根据MEROPS和GenBank数据库中的枯草杆菌类蛋白酶的编码区和成熟肽编码序列设计并合成了10条引物．富集培养胞外蛋白酶产生菌并提取了12个总DNA样品，分别用每对引物在降落PCR（Touchdown PCR，TD-PCR）条件下进行蛋白酶编码序列的扩增．选择了19个长800～1200bp的扩增片段测序，其结果为：8个是蛋白酶DNA片段，它们应属于4种不同的蛋白酶基因序列；同一对引物扩增到的基因序列差异性可达到32％，说明只使用基于已知序列的PCR方法从混合菌中获得新蛋白酶基因是可行的．将克隆到的1个与碱性蛋白酶E（GenBank No．AJ539133）的编码区99％相似的蛋白酶DNA片段插入pTWIN1载体，在大肠杆菌ER2566中进行表达．结果表明，表达的成熟蛋白酶可分泌到培养基中，能在牛奶平板上产生水解圈，对大肠杆菌有致死作用． 展开更多

关键词 非纯培养物 蛋白酶 基因克隆 降落PCR 碱性蛋白酶e 基因表达

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组织蛋白酶E氨基端催化性残基的确定

16

作者 刘剑 《中国现代医生》 2009年第20期1-3,共3页

目的验证组织蛋白酶E保守基序DTG中第98位天门冬氨酸残基为组织蛋白酶E氨基端催化性残基。方法通过基因定点突变技术将第98位天门冬氨酸残基用丙氨酸替代,制成变异体D98A,并将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在人胚胎肾293T细胞中... 目的验证组织蛋白酶E保守基序DTG中第98位天门冬氨酸残基为组织蛋白酶E氨基端催化性残基。方法通过基因定点突变技术将第98位天门冬氨酸残基用丙氨酸替代,制成变异体D98A,并将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在人胚胎肾293T细胞中进行异源表达。结果在细胞培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达。突变体D98A酶原在酸性条件下不能转变为酶,也没有酶活性。结论组织蛋白酶E第98位天门冬氨酸残基是酶的催化性残基,对酶的催化活性非常重要。 展开更多

关键词 活性部位基序 天门冬氨酸蛋白酶 组织蛋白酶e 变异体解析

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组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基对酶活性的作用

17

作者 刘剑 《中国临床新医学》 2009年第7期661-665,共5页

目的探讨组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基在酶活性中的作用。方法通过基因点突变，将大鼠组织蛋白酶E内羧基端的活性部位基序中第284位苏氨酸残基用丝氨酸进行替代，构建变异体T284S。结果当将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在HEK2... 目的探讨组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基在酶活性中的作用。方法通过基因点突变，将大鼠组织蛋白酶E内羧基端的活性部位基序中第284位苏氨酸残基用丝氨酸进行替代，构建变异体T284S。结果当将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在HEK293T细胞中进行异源表达时，在细胞培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达。突变体T284S仍具有自我转化为成熟型酶的能力，尽管它们的酶活性只是野生型的40％，变异体的Km值与野生型的相似，但它的Keat值却比野生型显著下降。变异体和野生型酶都被胃酶抑素和蛔虫胃蛋白酶抑制剂所抑制，Ki值几乎相同。变异体在各种酸碱度下的圆二色光谱与野生型基本相同。结论（1）第284位苏氨酸残基对酶的催化活性确实非常重要。变异体T284S酶催化活性的下降是由于多出来的甲基使活性部位氢键的分布发生改变，从而使酶与底物的作用模式发生改变。（2）BACE-1不能被胃酶抑素抑制，可能与羧基端结构域的活性部位基序差异无关，而与BACE1蛋白结构中的其它部分有关。 展开更多

关键词 活性部位基序 天门冬氨酸蛋白酶 组织蛋白酶e 变异体解析

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测定海产品中5种砷形态国家标准方法的改进

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作者 翁城武 高功敏 +2 位作者 朱鸿达 黄伙水 徐敦明 《理化检验（化学分册）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期319-323,共5页

国家标准GB5009.11-2014测定食品中砷形态含量时,前处理方法需经放置过夜、热提取、离心、萃取及过滤等较多步骤,耗时较长,且测定方法高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)中流动相需配制4种不同含量的无机盐,还须调节流... 国家标准GB5009.11-2014测定食品中砷形态含量时,前处理方法需经放置过夜、热提取、离心、萃取及过滤等较多步骤,耗时较长,且测定方法高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)中流动相需配制4种不同含量的无机盐,还须调节流动相酸度,较为复杂.针对上述问题,改进了国家标准前处理方法,优化了国家标准第二法的色谱条件,提出了基于微波辅助酶提取-HPLC-ICP-MS快速测定食品中5种砷形态含量的方法.将样品1.0 g、链霉蛋白酶E酶0.004 g和水20 mL置于微波提取仪中,于35℃提取45 min,提取液离心10 min,再经0.45μm水性滤膜过滤即得样品溶液.以Hamilton PRP-X100色谱柱为固定相,体积比99∶1的2.0 mmol􀅰L^(-1)的磷酸二氢铵溶液(pH 8.0)-乙醇的混合液为流动相等度洗脱,按仪器工作条件进行测定.结果表明:5种砷形态的标准曲线的线性范围均为2.5~30.0μg·L^(-1),检出限(3s/k)为0.50~0.60μg·L^(-1).按标准加入法进行回收试验,回收率为90.0%~103%,测定值的相对标准偏差(n=5)为0.80%~5.0%.方法用于实际样品的分析,并与GB 5009.11-2014中第二法的测定结果进行比对,结果表明改进后的方法与GB 5009.11-2014不存在显著性差异(P>0.05). 展开更多

关键词 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法 微波提取 链霉蛋白酶e酶 砷形态 海产品

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枯草杆菌蛋白酶E基因多位点定点突变库的构建及其筛选 被引量：1

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作者 谢毅 肖谷田 +4 位作者 张婕 孙筱清 吴小舟 王启松 陈小央 《中国科学（C辑）》 CSCD 1997年第2期97-102,共6页

利用化学合成的15个寡聚核苷酸片段作为诱变引物,同时对枯草杆菌蛋白酶E(Subtilisin E或Apr E)基因进行体外突变,获得了合全部突变位点各种随机组合突变的突变库,通过点杂交法和DNA序列分析肯定了该突变库的可靠性.从突变库中选择一单... 利用化学合成的15个寡聚核苷酸片段作为诱变引物,同时对枯草杆菌蛋白酶E(Subtilisin E或Apr E)基因进行体外突变,获得了合全部突变位点各种随机组合突变的突变库,通过点杂交法和DNA序列分析肯定了该突变库的可靠性.从突变库中选择一单点突变(Met222Ala)和3点突变(Asn76Asp/Asn109Ser/Ile205Cys)的基因进行克隆、表达和产物的酶学性质研究,发现其抗氧化性和热稳定性分别比野生型的有显著提高,与文献报道的一致.表明了该突变库在枯草杆菌蛋白酶工程研究中的应用价值. 展开更多

关键词 蛋白质工程 枯草杆菌 蛋白酶e基因 点突变库

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豚鼠支气管平滑肌细胞的分离 被引量：1

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作者 刘志洋 姚平 佟文革 《第四军医大学吉林军医学院学报》 2001年第1期26-27,共2页

目的　探讨豚鼠支气管平滑肌细胞的分离方法。方法　通过链霉蛋白酶E消化气管和肺组织 ,并辅以离心、机械吹打等手段 ,获取细胞后观察其形态、数目。结果　获得带状或纺锤状细胞 ,其细胞膜光滑、胞质均匀、核呈圆形或椭圆形 ;用乙酰胆... 目的　探讨豚鼠支气管平滑肌细胞的分离方法。方法　通过链霉蛋白酶E消化气管和肺组织 ,并辅以离心、机械吹打等手段 ,获取细胞后观察其形态、数目。结果　获得带状或纺锤状细胞 ,其细胞膜光滑、胞质均匀、核呈圆形或椭圆形 ;用乙酰胆碱刺激细胞能产生收缩。结论　用酶消化 30min ,以 12 0 0r/min离心 60min ,可获得形态较好、数目多。 展开更多

关键词 链霉蛋白酶e 平滑肌 支气管 分离

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