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溶血素 E基因原核表达载体的构建与蛋白诱导表达
1
作者 何学仙 何晓艳 潘晓玥 《宁夏医科大学学报》 2024年第7期663-666,共4页
目的构建大肠杆菌(Escherichia Coli,E.coli)溶血素E(Hemolysin E)基因的重组质粒pCZN1-hlyE,诱导表达目的蛋白。方法通过NCBI数据库检索获取E.coli Hemolysin E基因序列(NC_000913.3),采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的全... 目的构建大肠杆菌(Escherichia Coli,E.coli)溶血素E(Hemolysin E)基因的重组质粒pCZN1-hlyE,诱导表达目的蛋白。方法通过NCBI数据库检索获取E.coli Hemolysin E基因序列(NC_000913.3),采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的全基因合成法,设计全长拼接引物,合成目的基因,并成功构建重组质粒pCZN1-hlyE。将构建好的pCZN1-hlyE重组质粒转入大肠杆菌TOP10菌株中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Hemolysin E基因的表达,生成Hemolysin E毒力蛋白。结果经SDS-PAGE凝胶电泳,Western blot分析鉴定目的蛋白Hemolysin E分子量为28.72 kDa,与Hemolysin E基因核酸序列经DNAMAN软件分析所得蛋白分子量一致。结论被诱导表达的Hemolysin E蛋白存在于菌体裂解液上清中,并纯化制备重组蛋白。 展开更多
关键词 溶血素E 全基因合成 原核表达 蛋白诱导表达
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北沙参补骨脂素合成酶基因 GlPS1 原核表达载体的构建和蛋白诱导表达
2
作者 张馨方 宋洁洁 +3 位作者 徐瑶 田雪梅 谭玲玲 高婷 《青岛农业大学学报（自然科学版）》 2023年第2期118-123,共6页
北沙参(Glehniae Radix)为伞形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis)的干燥根,具有良好的药用价值和较高的经济价值。补骨脂素(psoralen)是北沙参香豆素类化合物主要的活性成分之一,对白血病细胞有较强的杀伤作用,对支气管平滑肌有舒张作... 北沙参(Glehniae Radix)为伞形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis)的干燥根,具有良好的药用价值和较高的经济价值。补骨脂素(psoralen)是北沙参香豆素类化合物主要的活性成分之一,对白血病细胞有较强的杀伤作用,对支气管平滑肌有舒张作用。补骨脂素合成酶(GlPS)是北沙参补骨脂素生物合成途径的最后一步关键酶。本试验通过PCR扩增获得对北沙参补骨脂素合成酶基因GlPS1,通过酶切、连接、转化、平板培养和提取质粒构建原核表达载体;将构建好的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,实现GlPS1基因的IPTG诱导原核表达。该研究表明被诱导表达的GlPS1蛋白存在于菌体沉淀中,不溶于上清液。研究结果为验证GlPS1基因的功能及使用基因工程方法调控GlPS1蛋白表达奠了基础。 展开更多
关键词 北沙参 GlPS1基因 原核表达载体构建 蛋白诱导表达
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ISG15蛋白泛素结合酶UBCH6的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：3
3
作者 李玉霄 唐榕泽 +5 位作者 高跃美 冯佳佳 李晓泉 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 《动物医学进展》 北大核心 2020年第12期28-33,共6页
通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低... 通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低温条件下,用低浓度的IPTG诱导表达UBCH6重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG诱导时UBCH6表达效果最好,而且UBCH6重组蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表达。UBCH6重组蛋白经过Ni-NTA纯化后与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合乳化并免疫4周龄昆明小鼠,从而制备出UBCH6多克隆抗体,重组真核表达载体pcDNA3.0-UBCH6以化学转染人工脂质体法导入293T细胞中,Western blot检测制备的UBCH6多克隆抗体能与真核表达细胞蛋白发生反应,反应效价可达1∶10000,反应性良好。Western blot检测UBCH6多克隆抗体的特异性,ISG15多克隆抗体、UBCH6多克隆抗体都能与接毒CSFV、转染PolyI:C的PK-15细胞蛋白发生良好反应,且蛋白表达量与时间呈正相关。 展开更多
关键词 ISG15蛋白 UBCH6基因 多克隆抗体 猪瘟病毒 蛋白诱导表达
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大鼠CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表达载体构建及蛋白表达
4
作者 孟利 杜彩萍 《中国科技纵横》 2022年第24期123-125,共3页
构建CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表达载体,转化于大肠杆菌BL-21细胞,并诱导蛋白的表达。以全长nNOS-pME18S重组体为模板,采用PCR扩增目的基因,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1;将重组成功的重组子CaM(nNOS)-pGEX-4T-1转化入BL-21细胞,加入诱导... 构建CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表达载体,转化于大肠杆菌BL-21细胞,并诱导蛋白的表达。以全长nNOS-pME18S重组体为模板,采用PCR扩增目的基因,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1;将重组成功的重组子CaM(nNOS)-pGEX-4T-1转化入BL-21细胞,加入诱导剂IPTG诱导CaM(nNOS)蛋白的表达,用SDS-PAGE及免疫印迹方法鉴定CaM(nNOS)的表达。CaM(nNOS)-pGEX-4T-1表达载体成功构建。在诱导温度为16℃,IPTG为0.5mmol/L条件下,诱导时间为20h,可在大肠杆菌中大量表达CaM。重组CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表达载体成功构建,蛋白表达成功。 展开更多
关键词 钙调素结合区 原核表达载体 蛋白诱导表达 神经型一氧化氮合酶
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肠致病性大肠埃希菌EspB基因的体外诱导表达研究 被引量：1
5
作者 郑金鑫 刘晓军 +5 位作者 李多云 马桂红 潘伟光 陈重 余治健 邓启文 《深圳中西医结合杂志》 2013年第4期193-196,共4页
目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白。方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pET-28... 目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白。方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pET-28a-EspB经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹试验(Western blot)分析。pET-28a-EspB表达产物再次经纯化,获得的纯化蛋白进一步经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证。结果:经双酶切和测序验证pET-28a-EspB重组质粒构建成功。pET-28a-EspB重组质粒经IPTG诱导后,在诱导表达不同时间点,培养菌液、沉淀和上清中均有良好的蛋白表达。经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证我们获得了纯化的EspB蛋白。结论:体外可成功诱导EPECEspB蛋白稳定高效表达并获得纯化EspB蛋白产物。 展开更多
关键词 肠致病性大肠埃希菌 EspB基因 重组质粒 蛋白诱导表达 蛋白质印迹试验
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肥城桃果实2-Cys Prx基因克隆、生物信息学分析及原核表达
6
作者 张永淋 高彬 +1 位作者 周杰 朱树华 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期50-55,共6页
为了深入研究2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号分子作用机制,结合了PCR技术和RT-PCR技术通过体外克隆的方法得到桃果实2-Cys Prx基因,通过对序列分析表明,2-Cys Prx基因全长1 424 bp,其中,编码区813 bp,共编码270个氨基酸。对其分... 为了深入研究2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号分子作用机制,结合了PCR技术和RT-PCR技术通过体外克隆的方法得到桃果实2-Cys Prx基因,通过对序列分析表明,2-Cys Prx基因全长1 424 bp,其中,编码区813 bp,共编码270个氨基酸。对其分子结构进行分析,2-Cys Prx蛋白分子量为29.7 ku,为疏水型蛋白,且是膜外蛋白。在线软件预测2-Cys Prx蛋白分子式为C1342H2110N348O403S4,分子量29.696 ku,由4 207个原子组成,理论等电点为6.23。使用Prot Scale分析该蛋白疏水性平均值为-0.126,说明2-Cys Prx为亲水性蛋白。TMHMM对跨膜结构进行预测,发现,2-Cys Prx氨基酸序列中不存在跨膜结构域,为膜外蛋白。此外,对该蛋白二级结构进行预测,发现2-Cys Prx有4个α螺旋结构、9个β折叠结构及无规则卷曲构成。系统进化树分析表明,肥城桃果实2-Cys Prx与其他植物氨基酸序列有较高同源性,其中与樱桃的亲缘关系最近,相似度达到了98.15%,表明植物体内2-Cys Prx具有较高的保守性。体外构建重组蛋白p ET-30a-2-Cys Prx成功在大肠杆菌BL21中表达,为下一步研究其功能与结构,从而探讨2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号作用机理奠定了基础。 展开更多
关键词 桃果实 2-Cys Prx 基因克隆 蛋白诱导表达
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双歧杆菌表达肠致病性大肠埃希菌EspA蛋白的体外研究
7
作者 余治健 李多云 +6 位作者 徐俊 刘晓军 邓名贵 潘伟光 郑金鑫 陈重 邓启文 《中国热带医学》 CAS 2014年第8期993-994,999,共3页
目的构建肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)EspA蛋白双歧杆菌表达重组菌株,并验证蛋白表达。方法采用常规PCR扩增EspA片段,体外构建重组质粒pBAD-EspA,转化大肠杆菌BL21感受态细胞培养,挑取单克隆提取质粒,双酶切和PCR... 目的构建肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)EspA蛋白双歧杆菌表达重组菌株,并验证蛋白表达。方法采用常规PCR扩增EspA片段,体外构建重组质粒pBAD-EspA,转化大肠杆菌BL21感受态细胞培养,挑取单克隆提取质粒,双酶切和PCR对重组质粒鉴定。pBAD-EspA电转化长双歧杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆并PCR鉴定,经木聚糖诱导表达,蛋白质印迹试验(Western blot)分析验证EspA蛋白在双歧杆菌中的表达。结果经酶切后琼脂糖凝胶电泳及测序结果证明pBAD-EspA重组质粒构建成功。pBAD-EspA重组质粒转化双歧杆菌后经阿拉伯糖诱导,在诱导表达不同时间点菌液沉淀均有良好的蛋白表达。结论体外成功构建表达EPEC EspA蛋白的长双歧杆菌,为制备ESPA口服疫苗提供科学依据。 展开更多
关键词 肠致病性大肠埃希菌 EspA基因 双歧杆菌 蛋白诱导表达
原文传递
修饰的pfu酶与T7ssb蛋白在聚合酶链式反应中的应用
8
作者 刘明珠 秦中强 +3 位作者 杨天华 陈勇 李永海 李正红 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期2220-2227,共8页
表达、纯化pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并优化PCR反应体系。分别将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,转化至原核细胞中,诱导表达出pfu、pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并通过His-Nickle亲和层析纯化柱纯化蛋白。从A549细胞中提取人的基因... 表达、纯化pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并优化PCR反应体系。分别将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,转化至原核细胞中,诱导表达出pfu、pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并通过His-Nickle亲和层析纯化柱纯化蛋白。从A549细胞中提取人的基因组DNA,以该基因组DNA为模板,利用pfu酶扩增c-met基因;同时从A549中提取总RNA,经过逆转录反应后,以逆转录产物c DNA为模板,分别利用pfu酶和pfu-sso7d酶扩增PD-L1基因,对比两种酶的DNA扩增效率;从MC38细胞中提取鼠的基因组DNA,以此基因组DNA为模板,分别用pfu-sso7d和pfu-sso7d联合T7ssb蛋白扩增Trp53基因,对比两种PCR反应体系的扩增效率。我们成功的将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,并成功的诱导表达并纯化了这三种蛋白;用pfu酶成功的扩增出c-met基因;对比pfu酶,pfu-sso7d表现出较高的DNA扩增效率;在扩增Trp53基因的PCR反应体系中,同单独使用pfu-sso7d酶相比,pfu-sso7d联合T7ssb蛋白在PCR反应体系中可以提高PCR产物的量,约1.7倍。本次研究表明,利用纯化的pfu-sso7d蛋白和T7ssb蛋白,我们构建了优化的PCR反应体系。 展开更多
关键词 聚合酶链反应 PFU DNA聚合酶 T7单链结合蛋白 重组蛋白诱导表达 蛋白纯化
原文传递
鸡β-防御素7的克隆与表达 被引量：1
9
作者 张开娟 云骜 +2 位作者 杨猛 卢艳 王文华 《现代畜牧科技》 2018年第6期1-4,共4页
防御素在抗生素取代方面有良好的发展前景,但目前在防御素大规模表达方面仍有难点。本实验着重探究如何实现防御素的大规模表达。实验通过设计目的基因引物、PCR扩增目的基因、将鸡β-防御素7(AvBD7)基因克隆到大肠杆菌BL21表达载体质粒... 防御素在抗生素取代方面有良好的发展前景,但目前在防御素大规模表达方面仍有难点。本实验着重探究如何实现防御素的大规模表达。实验通过设计目的基因引物、PCR扩增目的基因、将鸡β-防御素7(AvBD7)基因克隆到大肠杆菌BL21表达载体质粒pET32a中、扩增大肠杆菌、对鸡AvBD7基因进行鉴定、分离纯化目的蛋白并进行检测的过程方法,完成重组鸡AvBD7基因的克隆与表达,得到鸡AvBD7基因可以在大肠杆菌BL21中表达的结论,为鸡AvBD7基因的进一步临床应用打下基础。 展开更多
关键词 Β-防御素 原核表达 蛋白质诱导表达 蛋白质检测
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猪细小病毒VP2重组蛋白的诱导表达及表达产物的纯化
10
作者 孙超 高莹 +3 位作者 丁晨 佟洋 范慧 张宏玲 《今日畜牧兽医》 2018年第10期10-11,共2页
将构建好的重组质粒转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了VP2蛋白主要抗原域的高效表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定其表达形式;经滤膜、饱和硫酸铵、Ni-NTA树脂层析进行纯化。结果表明:重组质粒得到高效诱导表达,并且重组蛋白... 将构建好的重组质粒转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了VP2蛋白主要抗原域的高效表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定其表达形式;经滤膜、饱和硫酸铵、Ni-NTA树脂层析进行纯化。结果表明:重组质粒得到高效诱导表达,并且重组蛋白以包涵体的形式存在;获得高纯度的重组蛋白。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2重组蛋白的诱导表达 纯化
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